抗凝管中，5, 000r/min，离心10min，除去细胞沉淀。 将收集到的上清于56°C灭活30min，10, 000r/min，离心15min，然后进行纯化。在抽取小鼠 腹水前后做好消毒工作，抽取过程中尽量避免刺破小鼠脏器，可进行多次腹水采集。此外， 尚可使用单核细胞分离液分离小鼠腹水中的杂交瘤细胞冻存或继续进行腹水制备。
[0094] 采用琼脂糖亲和介质（ProteinA)纯化腹水。按产品使用说明书，具体过程如下：
[0095] a.平衡：用5~10柱体积的磷酸缓冲液平衡层析柱。
[0096] b.进料：将处理过的腹水经0. 22 μ m的滤膜过滤后转移至层析柱。
[0097] c.淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
[0098] d.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集流出液。洗脱后，立刻用IM Tris-HCKpH 9.0) 将收集到的McAb溶液pH值调至7. 4。
[0099] 对杂交瘤细胞2C5的培养上清液先稀释4倍后，再进行倍比稀释；对小鼠纯化前后 腹水先稀释5, 000倍后，再进行倍比稀释。同时，分别用SP2/0细胞上清、SP2/0细胞诱导 腹水作为阴性对照，用间接ELISA方法测定OD45tol值。P/N彡2. 1时McAb的最大稀释度即 为其抗体效价。由检测结果（表10至表11)可知，对数生长期2C5杂交瘤细胞培养上清液 效价为I :128 ;纯化前小鼠腹水效价为I :40, 000 ;纯化后小鼠腹水效价可达1 :320, 000,为 细胞培养上清液的2, 500倍。微量分光光度计测定纯化后腹水中IgG浓度为2. 8mg/mL，取 其14. 4 μ g进行考马斯亮蓝染色，结果如图3,可观察到两条条带，其中一条重链约53ku，另 一条轻链约22ku。
[0100] 表10细胞培养上清ELISA效价
[0101]
[0103] 表11小鼠腹水纯化前后ELISA效价
[0104]
[0105] 一、单克隆抗体免疫学性质
[0106] (1)单克隆抗体亚型鉴定：按照Envirologix所产的小鼠 McAb亚型鉴定试纸条说 明书操作，结果如图4,此McAb亚型为IgG2a，轻链为Kappa链。
[0107] (2)单克隆抗体的特异性鉴定：按实施例1步骤5所述ELISA操作程序分别用CDV、 CPV、CPIV、CAV- II、CRV 及 H7N9、H10N8、H3N8、H3N2 四种亚型流感病毒包被 ELISA 酶标板， 检测小鼠腹水的特异性；判定标准：P/N多2. 1为有交叉反应；反之，无交叉反应。
[0108] 间接ELISA表明，2C5分泌的McAb除与H3N2CIV发生反应，还与H3N8亚型EIV有 弱交叉反应，而与CDV、CPV、CPIV、CAV- II、CRV及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒均不发 生反应。
[0109] (3)单克隆抗体的间接免疫荧光试验
[0110] a.将对数生长期MDCK细胞铺至6孔细胞培养板。待细胞长至孔面积的50 %时使 用200 μ L H3N2CIV感染其中2孔细胞。另外2孔不感染，作阴性对照；
[0111] b.24h后，弃细胞培养基，每孔用ImL的4%多聚甲醛固定30min。PBS洗涤2次， 每次5min，80r/min(以下洗绦步骤相同）；
[0112] c. 0· 25% Trixton-IOO 处理细胞 IOmin 后，PBS 洗涤 2 次；
[0113] d.使用PBS配制的5 %脱脂奶粉封闭各孔30min后，PBS洗涤2次；
[0114] e.加入4, 000倍稀释的纯化小鼠腹水作一抗，37°C孵育2h。PBS洗涤3次；
[0115] f.以 Goat anti-Mouse IgG-FITC 作二抗。37°C孵育 2h。PBS 洗涤 3 次；
[0116] g.加少量PBS于孔内防干燥。在倒置荧光显微镜下观察结果。出现绿色荧光为阳 性，无绿色荧光为阴性。
[0117] 荧光实验结果如图5, H3N2CIV感染的MDCK细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性对 照未出现反应，对比明显。表明2C5分泌的McAb确与H3N2CIV的某些蛋白发生了反应，且 亲和力较高。
[0118] (4)单克隆抗体的Western Blot分析
[0119] 1、H3N2CIV 9种主要蛋白真核表达质粒的转染及各蛋白的收获
[0120] 提前ld，将对数期生长的293T细胞均匀铺到12孔板上，每孔细胞数为1~ 2X10 5/mL，当细胞密度达孔底面积40~60%时开始转染。每种质粒（9种蛋白的质粒为 现有）转染1孔细胞，设立阴性对照，质粒转染过程为常见的分子生物学技术，具体可参照 LIP0-2000 说明书。
[0121] 2、Western Blot鉴定单克隆抗体
[0122] a.取上步试验制备的各蛋白20yL，分别加5yL 5XSDS上样缓冲液，沸水中煮 IOmin ；
[0123] b.吸取10 μ L蛋白变性液进行SDS-PAGE电泳，设立正常293T细胞为阴性对照。
[0124] c.电泳结束后，采用半干转法将抗原转移到NC膜上，转膜条件为恒压15V，25min。
[0125] d. TBST洗涤NC膜2次，5min/次（以下洗涤相同）。之后将其置于5%脱脂奶粉 中4°C封闭过夜。弃封闭液，TBST洗涤2次。以纯化的小鼠腹水为一抗，37°C孵育a后，弃 一抗，TBST 洗涤 3 次。加入 1:10000 稀释的 Goat anti-Mouse IgG(H&L)-HRP 二抗，37°C孵 育2h，弃二抗，TBST洗涤3次。
[0126] e.按"增强型HRP-DAB底物显色试剂盒"说明书，在NC膜上加 DAB底物显色液，室 温，避光显色20min后，用CldH2O终止反应，观察结果。
[0127] 使用H3N2CIV 9种主要蛋白真核表达质粒分别转染293T细胞，共得到CIV的9种 蛋白，分别为咿、拟、？81、？82、？4、呢2、]?2、]\11和嫩。采用168七6111-81(^方法检测205杂 交瘤细胞分泌的McAb与何种蛋白反应。结果表明（图6):该McAb为抗H3N2CIV HA的抗 体，而且针对的是HA(约75ku)的线性抗原表位。
[0128] 实施例3双抗体夹心ELISA检测方法的建立
[0129] 兔源多克隆抗体的制备：取2只3kg新西兰大白兔，用纯化的H3N2CIV与等量FCA 超声乳化，背部皮下分多点注射，1.5mg/只。二免、三免分别于首免后第14d和第28d用 FICA与H3N2CIV乳化后作为抗原皮下注射，2mg/只。三免后心脏采血，分离血清，-20°C保 存备用。用间接ELISA法测定抗血清效价，使用微量分光光度计测定纯化（纯化步骤同实 施例2)后多抗浓度，取纯化后的样品进行考马斯亮蓝染色，检测纯化效果。
[0130] 表12兔源H3N2CIV多克隆抗体制备免疫程序
[0131]
[0132] 免疫结束后，每只兔子共获得约IOOmL血液，经离心后分离到血清约50mL，采用 间接ELISA法测得纯化前抗血清效价为1 :128000,如表13。血清纯化效果如图3所示， SDS-PAGE蛋白上样量为5. 4 μ g，同样可观察到两条条带，说明纯化效果较好。经微量分光 光度计测得纯化后H3N2CIV多克隆抗体浓度为I. 6mg/mL。
[0133] 表13兔源H3N2CIV抗血清ELISA测定结果
[0134]
[0135] 双抗夹心ELISA步骤如下：
[0136] (1)包被单抗：用pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释的，实施例2制备得到的鼠源McAb包 被酶标板，100 μ L/孔，4°C过夜孵育后，弃包被液，PBST洗涤5次（200 μ L/孔，2min/次）；
[0137] (2)封闭：加入封闭液，200 μ L/孔，37 °C孵育lh，弃封闭液，PBST洗涤3次 (20(^17孔，211^11/次）；
[0138] (3)加样：加入PBST稀释好的待测样品，100 μ L/孔，37°C孵育lh，弃样品液，PBST 洗涤 5 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）；
[0139] (4)孵育多抗：用？851'稀释兔源!13吧(^多克隆抗体，10(^17孔，37°〇孵育111， 弃多抗，PBST洗涤5次（200 μ L/孔，2min/次）；
[0140] (5)孵育酶标抗体：加 PBST 稀释好的 Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP，100 μ L/ 孔，37 °C孵育Ih，弃酶标抗体，PBST洗涤5次（200 μ L/孔，2min/次）；
[0141] (6)显色：各反应孔加入新配制的TMB底物溶液，100 μ L/孔，避光孵育15min ;
[0142] (7)加终止液：以同加底物的顺序加2M H2SO4终止反应，100 μ L/孔；
[0143] (8)测OD值：迅速用提前30min预热的酶标仪进行双波长检测，参考波长设定为 630nm，测定 0D45(lnm{t。
[0144] 判断标准同实施例1。每次进行ELISA试验均需设立阴阳性对照和空白对照，每个 样品重复2孔。
[0145] 一、最适H3N2CIV单克隆抗体包被浓度及H3N2CIV尿囊液稀释度的确定
[0146] 将 McAb 用 ρΗ9· 6 的碳酸盐缓冲液作 1、0· 5、0· 25、