壳蛋白的氨基酸序列；
[0089] 从所述比对的氨基酸序列确定共有序列；
[0090] 基于所述共有序列制备复合序列，其与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列 相比含有至少一个不同的氨基酸；和
[0091] 在宿主细胞中表达所述复合序列，由此产生病毒样颗粒。
[0092] 70.项69的方法，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒、小RNA病毒、星状病 毒、腺病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。
[0093] 71.项70的方法，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
[0094] 72.项71的方法，其中所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。
[0095] 73.项72的方法，其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
[0096] 74.项1的病毒样颗粒，其中所述多肽包含由SEQ ID NO:3的核酸序列编码的复合 氨基酸序列。
[0097] 附图简述
[0098] 图1.来自基因型组II，基因型4诺如病毒的VPl蛋白的共有氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)。该共有序列是从Houston、Minerva和Laurens株的比对确定的。
[0099] 图2.编码来自基因型组II，基因型4诺如病毒的复合VPl蛋白的核苷酸序列（SEQ ID NO:3)〇
[0100] 图3.经蔗糖梯度纯化的复合VLP的SDS-PAGE/考马斯分析。
[0101] 图4.通过蔗糖梯度纯化的复合表达细胞培养上清在220nm (顶部）和280nm(底 部）读数的HPLC SEC色谱图。
[0102] 图5.通过柱层析纯化的复合序列VLP的SDS-PAGE/银染分析。
[0103] 图6.复合VLP在280nm读数的HPLC SEC色谱图。
[0104] 图7.用复合VLP(CVLP)进行免疫引发抗原特异性IgG。将一组7只小鼠用多种 浓度的CVLP(在X轴标明）在第0日和第7日免疫（i.p.)。在第14日收集血清，并通过 ELISA测量CVLP特异性IgG。水平线表明每个处理组的几何平均值。
[0105] 图8.用复合VLP/诺沃克VLP (CVLP/NVLP)组合进行免疫引发NVLP特异性IgG。 将一组7只小鼠用多种浓度的NVLP本身（紫色棒）或其与等量CVLP(黑色棒）的组合在 第0日和第14日免疫（i.p.)。在第21日收集血清，并通过ELISA测量NVLP特异性的IgG。 数据报道为平均值+平均值的标准误差（SEM)。
[0106] 图9.用复合VLP/诺沃克VLP (CVLP/NVLP)组合进行免疫引发CVLP特异性IgG。 将一组7只小鼠用多种浓度的复合VLP本身（绿色棒）或其与等量NVLP (黑色棒）的组合 在第0日和第14日免疫（i.p.)。在第21日收集血清，并通过ELISA测量CVLP特异性的 IgG。数据报道为平均值+平均值的标准误差（SEM)。
[0107] 图10. CVLP特异性IgG与其他诺如病毒分离株交叉反应。在用复合VLP或 GII. 42002VLP进行单一免疫之后21日测量的抗体效价显示复合VLP与GII. 42002VLP相比 引发高~10倍的效价。针对用所有GII. 4VLP免疫的动物的抗体效价显示与GI. IVLP的不 良交叉反应性。数据表示为几何平均值+平均值的标准误差（SEM)。
[0108] 图11.将家兔在第0日和第21日用等量的诺沃克VLP (NVLP)和复合VLP (CVLP) 免疫（頂)。在第28日收集血清，并评估VLP特异性IgG。将所得的数据log转化，并通过 线性回归分析评估。IgG效价表示为稀释倍数的倒数，并作为几何平均值效价显示。
[0109] 图12.将家兔在第0日和第21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP) 免疫（IM)。在第75日收集脾，并在培养物中用NVLP或CVLP刺激未分级的细胞5日，并测 量胸苷的掺入量。对于在X轴上表示的处理组中的每只家兔显示平均值和SD。数据表示为 平均值+SD。
[0110] 图13.将家兔在第0日和第21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP) 免疫（頂)。在第75日收集脾和肠系膜淋巴结（LN)，并就VLP特异性记忆B细胞的存在通 过ELISP0T进行分析。显示了针对NVLP和CVLP的个体应答。数据表示为存在的每百万个 细胞中VLP特异性IgG分泌细胞的数量。
[0111] 图14.将家兔在第0、14和21日用等量的诺沃克VLP (NVLP)和复合VLP (CVLP)如 图例中所示进行免疫（頂)。在第21和35日收集血清，并通过ELISA测量NVLP特异性IgG 和IgA。结果表示为组的几何平均值+SEM。
[0112] 图15.将家兔在第0、14和21日用等量的诺沃克VLP (NVLP)和复合VLP (CVLP)如 图例中所示进行免疫接种（頂)。在第21和35日收集血清，并通过ELISA测量CVLP特异性 IgG和IgA。结果表示为组的几何平均值+SEM。
[0113] 图16.将家兔在第0、14和21日用等量的诺沃克VLP (NVLP)和复合VLP (CVLP)免 疫（頂)。在第35日收集脾，并在体外刺激未分级的细胞5日。用来自两个基因型组的多种 VLP如图例中所示刺激脾细胞。结果表示为组的几何平均值+SD。
[0114] 图17.将小鼠在第0和7日用等量的诺沃克VLP (NVLP)和复合VLP (CVLP)如X轴 上所示进行免疫（IP)。在第14日收集血清，并通过ELISA就VLP特异性IgG的存在进行分 析。显示个体的应答，且效价表示为稀释倍数的倒数。水平棒代表组的几何平均值。
[0115] 图18.将小鼠在第0和7日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)如X轴 上所示进行免疫（IP)。在第14日收集血清，并就能够抑制人红细胞（0型阳性）血凝的抗 体的存在进行分析。显示个体应答，且效价表示为稀释倍数的倒数。水平棒代表组的几何 平均值。
[0116] 图19.用50 μ g VLP疫苗制剂（诺沃克VLP+复合GII. 4VLP)在第0和21日进行 鼻内免疫的家兔中的血清抗VLP IgG。显示来自第35日收集的血清的个体应答，并将其表 示为μ g/mL。棒表明组的几何平均值。
[0117] 图20.来自基因型组II诺如病毒的VPl蛋白的氨基酸共有序列（SEQ ID N0:7)。 该共有序列是从 GII. 1(登录号：AAL13001)、GII. 2Snow Mountain (登录号：AAB61685)和 GII.3(登录号：AAL12998)株的比对确定的。"X"代表在全部三个株之间氨基酸均不同的 位置。
[0118] 图21.来自基因型组I诺如病毒的VPl蛋白的氨基酸共有序列（SEQ ID NO: 12)。 该共有序列是从诺沃克病毒（登录号：M87661)、Southampton (登录号：Q04542)和Chiba 病毒（登录号：BAB18267)株的比对确定的。"X"代表在全部三个株之间氨基酸均不同的位 置。
[0119] 图22.来自人乳头瘤病毒的Ll蛋白的氨基酸共有序列（SEQ ID NO: 17)。该共有 序列是从HPV-11、HPV-16和HPV18病毒株的比对确定的。"X"代表在全部三个株之间氨基 酸均不同的位置。
【具体实施方式】
[0120] 本发明提供包含具有复合氨基酸序列的多肽的疫苗组合物，其中所述复合氨基酸 序列源自无包膜病毒流行株的衣壳序列。从上述多肽序列产生的病毒样颗粒为几种病毒株 提供抗原性表位，并可用于诱导针对来自多种株的病毒感染提供保护的免疫应答。相应地， 本发明提供包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽的病毒样颗粒。如本文中使用的"复 合氨基酸序列"或"复合序列"是源自至少两种病毒蛋白序列的共有序列的序列。在一个实 施方案中，所述病毒蛋白序列是衣壳序列。复合氨基酸序列可通过在共有序列中的可变位 置选择两种或更多种氨基酸之一而源自共有序列。
[0121] 如本文中使用的"共有序列"是含有一个或多个可变氨基酸的序列，且其是通过比 对和比较两种或更多种病毒的病毒蛋白序列来确定的。共有序列还可通过比对和比较两种 或更多种病毒的核苷酸序列来确定。所述共有序列可从无包膜病毒的两种或更多种、三种 或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或者 九种或更多种流行株的蛋白质或核苷酸序列来确定。
[0122] 所述具有复合氨基酸序列的多肽与用于确定共有序列的两种或更多种流行株的 各个蛋白质序列相比可含有至少一个不同的、至少两个不同的、至少三个不同的、至少四个 不同的、至少五个不同的、至少六个不同的、至少七个不同的、至少八个不同的、至少九个不 同的、至少十个不同的、至少十五个不同的、至少二十个不同的、至少二十五个不同的、至少 三十个不同的、至少三十五个不同的、至少四十个不同的、至少四十五个不同的或至少五十 个不同的氨基酸。在一些实施方案中，具有复合氨基酸序列的多肽当在宿主细胞中表达时 可形成病毒样颗粒。
[0123] 在本发明的一个实施方案中，所述病毒样颗粒（VLP)包含至少一个具有复合氨基 酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣 壳蛋白的共有序列，且其中所述至少一个多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒，并 与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。优选地，所 述病毒样颗粒具有无包膜病毒的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多 种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或者九种或更多种流行株的抗原性质。在 一些实施方案中，所述病毒样颗粒使得针对无包膜病毒的一种或多种、两种或更多种、三种 或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或者 九种或更多种流行株的抗血清交叉反应性与用仅含有来自一种或多种流行株的蛋白质的 病毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比有所增加。在一个实施方案中，所述病毒 样颗粒提供在抗血清交叉反应性上为至少两倍的增加（two-fold increase)。
[0124] 在另一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至少一种具有复合氨基酸序列的多 肽，所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序 列，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒、小RNA病毒、星状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、 多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。本发明还包括在提交时尚未表征或发现 的无包膜病毒株。在一些实施方案中，除了其他之外，所述无包膜病毒为杯状病毒。杯状病 毒分为四个属：导致人类感染的诺如病毒（Norovirus)和札幌病毒（Sapovirus)，以及与动 物感染相关的兔病毒（Lagovirus)和囊泡病毒（Vesivirus)。在优选的实施方案中，所述杯 状病毒是札幌病毒或诺如病毒。
[0125] 诺如病毒属主要地分为两个大基因型组（GI和GII)。提出了两个其他的组 (GIII和GIV)，且其一般而言被接受。GIII的代表是牛、Jena株。GIV目前含有一个病 毒，Alphatron。GI和GII组可进一步基于遗传分类分为簇或基因型（Ando等（2000) J.Infectious Diseases, Vol. 181 (Supp2):S336_S348;Lindell 等（2005) J. Clin. Microbiol·, Vol. 43 (3) :1086 - 1092)。如本文中使用的术语遗传族（genetic cluster) 可与术语基因型互换使用。在基因型组I内，有6个GI簇（括号内为原型病毒株名）： GI. 1(诺沃克）；GI. 2 (Southhampton) ;GI. 3 (Desert Shield) ;GI. 4 (Cruise Ship virus/ Chiba) ;GI. 5(318/Musgrove);以及GI. 6(Hesse)。在基因型组 II 内，有9个GII 簇（括号内 为原型病毒株名）：GII. I(Hawaii) ;GII.2(Snow Mountain/Melksham) ;GII.3(Toronto); GII.4 (Bristol/Lordsdale) ；GI1.5 (290/Hi11ingdon) ；GI1.6 (269/Seacroft)； 011.7(273/1^6(18);611.8(539/^1118七6^3111) ;以及611.9(378)。流行诺如病毒株是通过将 其与属于这些遗传簇的原型株相比较来进行分类的。最流行的流行株属于基因型组II。
[0126] 已知多种诺如病毒分离株的核酸和蛋白质序列。其他来自诺如病毒分离株的代表 性、非限定性序列，包括0RF1、0RF2、0RF3及其编码的多肽的序列列于National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库。在本发明的一个实施方案中，所述诺如病毒可 为基因型组I或基因型组II诺如病毒。可根据任何已知的诺如病毒株确定复合和共有氨 基酸序列。参见，例如GenBank条目：诺如病毒基因型组1株Hu/NoV/WestChester/2001/ USA，GenBank 登录号 AY502016 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/fcaddock Heights/1999/ USA，GenBank 登录号 AY502015 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Fayette/1999/USA， GenBank 登录号 AY502014 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Fairfield/1999/USA，GenBank 登录号AY502013 ;诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Sandusky/1999/USA，GenBank登录号 AY502012 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Canton/1999/USA，GenBank 登录号 AY502011 ; 诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Tiffin/1999/USA，GenBank登录号AY502010 ;诺如病毒基 因型组2株Hu/NoV/CS-El/2002/USA，GenBank登录号AY50200 ;诺如病毒基因型组1株 Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA，GenBank 登录号 AY502008 ;诺如病毒基因型组 1 株 Hu/NoV/ CS-841/2001/USA，GenBank 登录号 AY502007 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Hiram/2000/ USA，GenBank 登录号 AY502006 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Tontogany/1999/USA， GenBank登录号AY502005 ;诺沃克病毒，全基因组，GenBank登录号NC. sub. -001959 ; 诺如病毒Hu/GI/Otofuke/1979/JP基因组RNA，全基因组，GenBank登录号AB187514 ;诺 如病毒 Hu/Hokkaido/133/2003/JP，GenBank 登录号 AB212306 ;诺如病毒 Sydney 2212， GenBank 登录号 AY588132 ;诺沃克病毒株 SN2000JA，GenBank 登录号 AB190457 ;Lordsdale 病毒全基因组，GenBank登录号X86557 ;诺沃克样病毒基因组RNA，Gifu' 96, GenBank登 录号AB045603 ;诺沃克病毒株Vietnam 026,全基因组，GenBank登录号AF504671 ;诺如 病毒 Hu/GII. 4/2004/N/L，GenBank 登录号 AY883096 ;诺如病毒 Hu/GII/Hokushin/03/ JP，GenBank 登录号 AB195227 ;诺如病毒 Hu/GII/Kamo/03/JP，GenBank 登录号 AB195228 ; 诺如病毒 Hu/GII/Sinsiro/97/JP，GenBank 登录号 AB195226 ;诺如病毒 Hu/GII/Ina/02/ JP，GenBank 登录号 AB195225 ;诺如病毒 Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE，GenBank 登录号 AY772730 ;诺如病毒 Hu/NLV/Dresdenl74/pUS-NorII/1997/GE，GenBank 登录号 AY741811 ;诺如病毒 Hu/NLV/0xford/B2S16/2002/UK，GenBank 登录号 AY587989 ;诺如病 毒 Hu/NLV/0xford/B4S7/2002/UK，GenBank 登录号 AY587987 ;诺如病毒 Hu/NLV/Witney/ B7S2/2003/UK，GenBank 登录号 AY588030 ;诺如病毒 Hu/NLV/Banbury/B9S23/2003/UK， GenBank 登录号 AY588029 ;诺如病毒 Hu/NLV/ChippingNorton/2003/UK，GenBank 登录 号 AY588028 ;诺如病毒 Hu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK，GenBank 登录号 AY588027 ;诺 如病毒 Hu/NLV/0xford/B8S5/2002/UK，GenBank 登录号 AY588026 ;诺如病毒 Hu/NLV/ 0xford/B6S4/2003/UK，GenBank 登录号 AY588025 ;诺如病毒 Hu/NLV/0xford/B6S5/2003/ UK，GenBank 登录号 AY588024 ;诺如病毒 Hu/NLV/0xford/B5S23/2003/UK，GenBank 登录 号 AY588023 ;诺如病毒 Hu/NLV/0xford/B6S2/2003/UK，GenBank 登录号 AY588022 ;诺如 病毒 Hu/NLV/0xford/B6S6/2003/UK，GenBank 登录号 AY588021 ;诺沃克样病毒分离株 Bo/ Thirskl0/00/UK，GenBank 登录号 AY126468 ;诺沃克样病毒分离株 Bo/Penrith55/00/UK， GenBank 登录号 AY126476 ;诺沃克样病毒分离株 Bo/Aberystwyth24/00/UK，GenBank 登 录号AY126475 ;诺沃克样病毒分离株Bo/Dumfries/94/UK，GenBank登录号AY126474 ;诺 如病毒 NLV/IF2036/2003/Iraq，GenBank 登录号 AY675555 ;诺如病毒 NLV/IF1998/2003/ Iraq，GenBank 登录号 AY675554 ;诺如病毒 NLV/BUDS/2002/USA，GenBank 登录号 AY660568 ; 诺如病毒 NLV/ParisIsland/2003/USA，GenBank 登录号 AY652979 ;Snow Mountain 病毒， 全基因组，GenBank 登录号 AY134748 ;诺沃克样病毒 NLV/Fort Lauderdale/560/199