8/ US，GenBank 登录号 AF414426 ;Hu/Norovirus/hi;roshima/1999/JP(9912-〇2F)，GenBank 登录号AB044366 ;诺沃克样病毒株11MSU-MW，GenBank登录号AY274820 ;诺沃克样病 毒株B-1SVD，GenBank登录号AY274819 ;诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA，GenBank 登录号 AY502023 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/CS-G4/2002/ USA，GenBank 登录号 AY502022 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/CS-G2/2002/USA， GenBank 登录号 AY502021 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/CS-G12002/USA，GenBank 登 录号 AY502020 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Anchorage/2002/USA，GenBank 登录号 AY502019 ;诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/CS-Dl/2002/CAN，GenBank 登录号 AY502018 ; 诺如病毒基因型组 2 株 Hu/NoV/Germanton/2002/USA，GenBank 登录号 AY502017 ;人杯 状病毒 NLV/GII/Langenl061/2002/DE，全基因组，GenBank 登录号 AY485642 ;鼠类诺如 病毒1多蛋白，GenBank登录号AY228235 ;诺沃克病毒，GenBank登录号AB067536 ;人 杯状病毒 NLV/Mex7076/1999, GenBank 登录号 AF542090 ;人杯状病毒 NLV/Oberhausen 455/01/DE，GenBank 登录号 AF539440 ;人杯状病毒 NLV/Herzberg 385/01/DE，GenBank 登录号 AF539439 ;人杯状病毒 NLV/Boxer/2001/US，GenBank 登录号 AF538679 ;诺沃克 样病毒基因组RNA，全基因组，GenBank登录号AB081723 ;诺沃克样病毒基因组RNA，全基 因组，分离株：Saitama U201，GenBank登录号AB039782 ;诺沃克样病毒基因组RNA，全基 因组，分离株：Saitama U18, GenBank登录号AB039781 ;诺沃克样病毒基因组RNA，全基 因组，分离株：Saitama U25, GenBank 登录号 AB039780 ;诺沃克病毒株：U25GII，GenBank 登录号AB067543 ;诺沃克病毒株：U201GII，GenBank登录号AB067542 ;诺沃克样病毒株 416/97003156/1996/LA，GenBank 登录号 AF080559 ;诺沃克样病毒株 408/97003012/1996/ FL， GenBank 登录号 AF080558 ;诺沃克样病毒 NLV/Burwash Landing/331/1995/ US， GenBank 登录号 AF414425 ;诺沃克样病毒 NLV/Miami Beach/326/1995/US， GenBank 登录号 AF414424 ;诺沃克样病毒 NLV/White River/290/1994/US，GenBank 登录号 AF414423 ;诺沃克样病毒 NLV/New 0rleans/306/1994/US，GenBank 登录 号 AF414422 ;诺沃克样病毒 NLV/Port Canaveral/301/1994/US，GenBank 登录号 AF414421 ;诺沃克样病毒 NLV/Honolulu/314/1994/US，GenBank 登录号 AF414420 ; 诺沃克样病毒 NLV/Richmond/283/1994/US，GenBank 登录号 AF414419 ;诺沃克样 病毒 NLV/Westover/302/1994/US，GenBank 登录号 AF414418 ;诺沃克样病毒 NLV/ UK3-17/12700/1992/GB，GenBank 登录号 AF414417 ;诺沃克样病毒 NLV/Miami/81/1986/US， GenBank 登录号 AF414416 ;Snow Mountain 株，GenBank 登录号 U70059 ;Desert Shield病毒 DSV395,GenBank登录号U04469 ;诺沃克病毒，全基因组，GenBank登录号AF093797 ;Hawaii 杯状病毒，GenBank登录号U07611 ;Southampton病毒，GenBank登录号L07418 ;诺沃克病毒 (SRSV-KY-89/89/J)，GenBank 登录号 L23828 ;诺沃克病毒（SRSV-SMA/76/US)，GenBank 登 录号 L23831 ;Camberwell 病毒，GenBank 登录号 U46500 ;人杯状病毒株 Melksham，GenBank 登录号X81879 ;人杯状病毒株MX，GenBank登录号U22498 ;小呼肠孤病毒TV24, GenBank 登录号 U02030 ;以及诺沃克样病毒 NLV/Gwynedd/273/1994/US，GenBank 登录号 AF414409 ; 所有这些的序列（如本申请的提交日时登入的）通过提述并入本文。其他诺如病毒序列 公开于下述专利公开：W0 2005/030806, WO 2000/79280, JP2002020399，US2003129588， U. S. Pat. No. 6, 572, 862, WO 1994/05700,以及 W005/032457,其均通过全文提述并入本 文。还参见 Green 等（2000) J. Infect. Dis.，Vol. 181 (Suppl. 2) : S322-330 ;Wang 等（1994) J. Virol.，Vol. 68:5982-5990 ;Chen 等（2004) J. Virol.，Vol. 78:6469-6479 ;Chakravarty 等（2005)J. Virol.，Vol. 79:554-568 ;Hansman 等（2006)J. Gen. Virol.，Vol. 87:909-919 ; Bull 等（2006) J. Clin. Micro.，Vol. 44 (2) : 327-333 ;Siebenga，et al. (2007) J. Virol.，Vo I. 81 (18) :9932-9941，and Fankhauser 等（1998) J. Infect. Dis.，Vol. 178:1571-1578;以 供序列比较以及诺如病毒的遗传多样性的讨论和系统进化分析。
[0127] 还已知多种札幌病毒分离株的核酸和蛋白质序列。代表性札幌病毒序列，包 括ORFl和0RF2的序列，和其来自札幌病毒分离株的编码的多肽列于National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库。参见，例如 GenBank 条目：札幌病毒 MclO, GenBank 登录号 NC. sub. -010624 ;Sapporo 病毒，GenBank 登录号 U65427 ;札幌 病毒 MclO, GenBank 登录号 AY237420;札幌病毒 SaKaeo-15/Thailand，GenBank 登录号 AY646855 ;Sapporo 病毒，GenBank 登录号 NC. sub. -006269 ;札幌病毒 C12, GenBank 登 录号 NC. sub. -006554 ;札幌病毒 C12, GenBank 登录号 AY603425 ;札幌病毒 Hu/Dresden/ pJG-SapOl/DE，GenBank 登录号 AY694184 ;人杯状病毒 SLV/cruise ship/2000/USA， GenBank登录号AY289804 ;人杯状病毒SLV/Arg39, GenBank登录号AY289803 ;猪肠杯状病 毒株 LL14, GenBank 登录号 AY425671 ;猪肠杯状病毒，GenBank 登录号 NC. sub. -000940 ; 人杯状病毒株Mc37, GenBank登录号AY237415 ;水紹肠杯状病毒株Canadal51A，GenBank登 录号AY144337 ;人杯状病毒SLV/Hou7-1181，GenBank登录号AF435814 ;人杯状病毒SLV/ Mexl4917/2000, GenBank 登录号 AF435813 ;人杯状病毒 SLV/Mex340/1990, GenBank 登录 号 AF435812 ;猪肠杯状病毒，GenBank 登录号 AF182760 ;Sapporo 病毒-London/29845， GenBank 登录号 U95645 ;Sapporo 病毒-Manchester，GenBank 登录号 X86560 ;Sapporo 病毒-Houston/86，GenBank 登录号 U95643 ; Sapporo 病毒-Houston/90，GenBank 登录 号 U95644 ;以及人杯状病毒株 HuCV/Potsdam/2000/DEU，GenBank 登录号 AF294739 ;所有 这些的序列（如本申请的提交日时登入的）通过提述并入本文。还参见Schuffenecker 等（2001)Arch Virol.，Vol. 146 (11) :2115-2132 ;Zintz 等（2005) Infect. Genet. Evol.，Vol. 5:281-290 ;Farkas 等（2004) Arch. Virol.，Vol. 149:1309-1323 ;以供序列比较 以及札幌病毒的遗传多样性的讨论和系统进化分析。
[0128] 所述复合和共有氨基酸序列可源自至少两个诺如病毒基因型组I或基因型组II 株的衣壳序列。在一个实施方案中，所述VLP包含具有复合序列的多肽，所述复合序列源 自来自两种或更多种基因型组II，基因型4诺如病毒株的衣壳蛋白的共有序列。基因型组 II，基因型4诺如病毒株的非限定性实例包括Houston株、Minerva株、Laurens株、Bristol 株、Lordsdale 株、Farmington Hills 株、Hunter 株、Carlow 株以及 US95/96_US、2006a 和 2006b 株。
[0129] 在本发明的另一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至少一种复合多肽，其中所 述复合多肽的序列源自Houston、Minerva和Laurens的VPl序列。在另一个实施方案中， 所述复合序列是SEQ ID NO: 1。还在另一个实施方案中，基于HoustoruMinerva和Laurens 的复合序列可源自SEQ ID N0:2定义的共有序列。
[0130] 在一些实施方案中，所述共有序列可根据来自至少两个不同的基因型或至少两个 不同的基因型组的诺如病毒株确定。在本发明的一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至 少一个具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自来自一个基因型组内至 少两个不同的基因型的诺如病毒株衣壳蛋白的共有序列。试举一例，所述共有序列可源自 基因型组II，基因型2和基因型组II，基因型4诺如病毒株的衣壳序列。在另一个实施方 案中，所述共有序列可源自一个基因型组内三个或更多个基因型的衣壳序列。
[0131] 在其他实施方案中，所述共有序列可根据来自至少两个不同的基因型组的诺如病 毒株确定。上述实施方案之一，可为包含具有复合氨基酸序列的多肽的VLP，其中所述复合 氨基酸序列源自基因型组I，基因型1和基因型组II，基因型4诺如病毒株的衣壳蛋白的共 有序列。
[0132] 本发明还提供包含复合多肽的病毒样颗粒（VLP)，所述复合多肽源自来自诺如病 毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列以及来自第二诺如病毒的衣壳蛋白。所 述来自第二诺如病毒的衣壳蛋白可为主要衣壳蛋白VP1，其由0RF2编码，或次要衣壳蛋白 VP2,其由0RF3编码，或VPl和VP2的组合。在一个实施方案中，所述来自第二诺如病毒的 衣壳蛋白是来自基因型组I诺如病毒的VPl蛋白。
[0133] 在另一个实施方案中，本发明提供包含复合多肽和第二多肽的VLP，前一多肽源自 代表杯状病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，所述第二多肽具有第二复合 氨基酸序列，其中所述第二复合氨基酸序列源自代表第二杯状病毒的两种或更多种流行株 的衣壳蛋白的共有序列。优选地，所述病毒样颗粒具有所述第一杯状病毒两种或更多种流 行株和所述第二杯状病毒两种或更多种流行株的抗原性质。
[0134] 所述第二多肽与第二杯状病毒所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比 含有至少一个不同的、至少三个不同的、至少五个不同的、至少十个不同的、至少十五个不 同的、至少二十个不同的、至少二十五个不同的、至少三十个不同的、至少三十五个不同的、 至少四十个不同的、至少四十五个不同的或至少五十个不同的氨基酸。在一些实施方案中， 所述第二多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒。在另一个实施方案中，所述第二杯 状病毒是诺如病毒。在另一个实施方案中，所述诺如病毒是基因型组I诺如病毒。所述基 因型组I诺如病毒可为本文中公开的任何基因型组I株。在一个实施方案中，所述基因型 组I诺如病毒选自下组：诺沃克病毒、Southampton病毒、Hesse病毒和Chiba病毒。
[0135] 本发明还涵盖分离的多肽或其片段，其具有本文中定义的复合氨基酸序列，以及 编码它们的核酸或载体。在一个实施方案中，所述分离的多肽或其片段具有复合氨基酸序 列，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有 序列，且其中所述多肽与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少一个不 同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株 的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述复合序列与所述 无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有5-50个不同的氨基酸。还在另一个 实施方案中，所述共有序列是SEQ ID N0:2。
[0136] 所述复合多肽可具有源自本文中公开的任何无包膜病毒两种或更多种流行株的 序列。在一个实施方案中，所述无包膜病毒是杯状病毒。在另一个实施方案中，所述杯状病 毒是诺如病毒或札幌病毒。在另一个实施方案中，所述诺如病毒是基因型组I或基因型组 II诺如病毒，或其组合。还在另一个实施方案中，所述分离的多肽具有SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列。
[0137] 在一个实施方案中，本发明提供编码具有复合氨基酸序列的多肽的分离的核酸， 其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序 列，且其中所述多肽与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少一个不同 的氨基酸。在另一个实施方案中，所述核酸具有SEQ ID N0:3的序列。在另一个实施方案 中，本发明提供包含编码复合多肽的分离的核酸的载体。还在另一个实施方案中，本发明提 供包含编码复合多肽的载体的宿主细胞。
[0138] 本发明的抗原性分子（例如，VLP、多肽及其片段）可通过从其天然存在的生物 分离并纯化来制备，或其可通过重组技术来制备。一旦分离或合成了所需的颗粒形成多肽 的编码序列，可将其克隆入任何合适的载体或复制子以供表达。多种克隆载体对本领域技 术人员是已知的，且本领域一般技术人员有能力选择适当的克隆载体。然后将载体用于转 化适当的宿主细胞。合适的重组表达系统包括但不仅限于细菌（例如大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis)和链球菌（Streptococcus))，杆状病毒 / 昆虫、牛痕、Semliki Forest病毒（SVF)、甲病毒（如辛德比斯病毒（Sindbis)、委内瑞拉马脑炎（VEE)病毒 (Venezuelan Equine Encephalitis))、哺乳动物（例如中国仓鼠卵巢（CHO)细胞、HEK-293 细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾（BHK)细胞、小鼠骨髓瘤（SB20)细胞和猴肾细胞（C0S))、酵 母（例如酿酒酵母（S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（S. pombe)、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastori)和其他毕赤酵母表达系统）、植物和非洲蟾蜍（Xenopus)表达系统，以及其他本领 域已知的表达系统。特别优选的表达系统是哺乳动物细胞系、细菌、昆虫细胞和酵母表达系 统。
[0139] 每一种前述抗原（例如VLP、多肽或其片段）优选以基本上纯的状态使用。取决于 选定的表达系统和宿主，VLP是通过在颗粒形成多肽表达且VLP可形成的条件下培养由表 达载体转化的宿主细胞来产生的。适当生长条件的选择属于本领域的技术。
[0140] 优选地，VLP抗原是从昆虫细胞如Sf9、High Five、TiniPro、埃及伊蚊（Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica)、家蚕（Bombyx mori)、黑腹果 幡（Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni)制备的。用于在昆虫细胞培养中产生VLP的方法在本领域是众所周知 的（参见例如美国专利6, 942, 865号，其通过全文提述并入本文）。简言之，携带所述复合 衣壳序列的重组杆状病毒是从合成cDNA构建的。然后将重组杆状病毒用于感染昆虫细胞 培养物（例如Sf9、High Five和TniPro细胞），而复合VLP可从细胞培养物分离。"复合 VLP"是包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽的VLP，所述复合氨基酸序列源自代表无 包膜病毒两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。
[0141] 如果VLP是在胞内形成的，则可使用化学、物理或机械手段破坏细胞，其裂解 细胞但使得VLP基本上保持完好。上述方法对本领域技术人员是已知的，且公开于例 如 Protein Purification Applications:A Practical Approach, (E. L. V. Harris 和 S. Angal，Eds.，1990)。
[0142] 然后使用保持颗粒完整性的方法分离（或基本上纯化）所述颗粒，如通过密度 梯度离心（例如鹿糖梯度）、PEG沉淀、成粒（pelleting)等（参见例如Kirnbauer等，J. Virol. (1993)67:6929-6936)以及标准纯化技术，包括例如离子交换和凝胶过滤层析。
[0143] 适用于本发明的描述分子生物学技术如克隆、突变等的一般性文献，包 括 Berger 和 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. (Berger) ；Sambrook 等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold