Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y· ,2000( "Sambrook"）以及 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等，eds.，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons, Inc. , (Ausubel"）。这些文 献描述了诱变，载体的使用，启动子和许多其他涉及例如无包膜病毒（如杯状病毒）衣壳蛋 白的克隆和表达相关的主题。
[0144] 在一些实施方案中，本发明的抗原性分子（例如VLP、多肽及其片段）在体内通过 施用包含编码复合多肽的分离的核酸来产生。合适的载体包括但不仅限于病毒载体如水 泡性口炎病毒（VSV)载体、马脑炎病毒（EEV)载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒 (AAV)、逆转录病毒载体，以及表达质粒如 pFastBacl、pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、 pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0145] 本发明还涵盖包含本发明中描述的VLP、多肽或核酸的疫苗制剂。在一个实施方案 中，所述疫苗制剂包含复合VLP和第二病毒样颗粒，其中所述第二病毒样颗粒包含来自诺 如病毒的衣壳蛋白。所述第二VLP可包含来自基因型组I或基因型组II诺如病毒的天然 衣壳蛋白。所述第二VLP可包含全长诺如病毒衣壳蛋白如VPl和/或VP2蛋白或某些VPl 或VP2衍生物。或者，所述第二VLP包含截短的衣壳蛋白，如截短的VPl蛋白。所述截短可 为N或C端截短。适合地，截短的衣壳蛋白为功能性衣壳蛋白衍生物。功能性衣壳蛋白衍生 物能够以与由全长衣壳蛋白组成的VLP引发免疫应答相同的方式引发免疫应答。包含VLP 混合物的疫苗制剂描述于W02008/042789,其通过全文提述并入本文。纯系试举一例，所述 疫苗制剂可含有来自一种或多种诺如病毒基因型组I株的VLP，以及包含来自一种或多种 诺如病毒基因型组II株的复合蛋白的VLP。优选地，所述诺如病毒VLP混合物由诺沃克和 基因型组II，基因型4诺如病毒的株组成。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂包含复合 VLP和诺沃克VLP，其中所述复合VLP包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的多肽。还在另 一个实施方案中，所述疫苗制剂包含第一复合VLP和第二复合VLP，其中所述第一和第二复 合VLP包含至少一种源自不同共有序列的多肽。例如，第一复合VLP包含来自一种或多种 诺如病毒基因型组I株的复合蛋白，而第二复合VLP包含来自一种或多种诺如病毒基因型 组II株的复合蛋白。在一个实施方案中，所述第一复合VLP包含来自诺如病毒基因型组I， 基因型1(GI. 1)的一种或多种株的复合蛋白，而第二复合VLP包含来自诺如病毒基因型组 II，基因型4(GII. 4)的一种或多种株的复合蛋白。
[0146] 在一些实施方案中，所述疫苗制剂进一步包含佐剂。大部分佐剂含有设计为保 护抗原免受快速代谢的物质如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答的刺激剂如百日咳博 德特氏菌（Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis) 来源的蛋白。合适的佐剂是商业上可获得的，例如弗氏不完全和完全佐剂（Pifco Laboratories, Detroit, Mich. ) ;Merck 佐剂 65 (Merck and Company, Inc. , Rahway, N. J.)； 矿物盐，包括铝盐如氢氧化铝凝胶（alum)或磷酸铝和钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸酰化 糖的不可溶悬液；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物降解性微球；以及Quil A。
[0147] 合适的佐剂还包括但不仅限于toll样受体（TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、 合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽（MDP)衍生物、 CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌脂多糖（LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体（virosome)、蜗状佐剂 (cochleate)、聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、水包 油乳剂、MF59和鲨烯。在一些实施方案中，所述佐剂为细菌来源的外毒素。在其他实施方 案中，可使用刺激Thl型应答的佐剂如3DMPL或QS21。在某些实施方案中，所述佐剂是MPL 和氢氧化铝的组合。
[0148] 在一些实施方案中，所述佐剂是单磷酰基脂质A(MPL)。MPL是来自沙门氏 菌（Salmonella)的脂质A的无毒衍生物，其为强力的TLR-4激动剂，其已作为疫苗佐 剂得到 了开发（Evans 等（2003)Expert Rev Vaccines, Vol. 2:219-229)。在鼠类前临 床研宄中，已显示鼻内MPL给药增强分泌以及全身性体液应答（Baldridge等（2000) Vaccine, Vol. 18:2416-2425 ;Yang 等（2002)Infect Immun.，Vol. 70:3557-3565)。还已 在超过120, 000位患者的临床研宄中证明其作为疫苗佐剂是安全和有效的（Baldrick 等（2002)Regul Toxicol Pharmacol，Vol.35:398-413)。 MPL 通过 TLR-4受体刺激 对先天免疫的诱导，并因此能够引发针对广泛范围的感染性病原体包括革兰氏阴性 和革兰氏阳性细菌、病毒和寄生物的非特异性免疫应答（Persing等（2002)Trends Microbiol, Vol. 10: S32-37)。在鼻内制剂中包含MPL应提供了对先天应答的快速诱导，弓丨 发了来自病毒攻击的非特异性免疫应答，同时增强了由疫苗的抗原性组分生成的特异性应 答。在一些实施方案中，MPL可与一种或多种附加的佐剂组合。例如，MLP可与氢氧化铝合 并构成合适的佐剂以供疫苗制剂的肌肉内给药。
[0149] 在其他实施方案中，所述佐剂是天然存在的油如鲨烯。鲨烯是由植物产生的三萜 烃类油（C 3tlH5tl),且存在于多种食物中。人类也产生大量的鲨烯，因为其充当胆固醇和甾类 激素的前体。其在肝和皮肤中合成，由极低密度脂蛋白（VLDL)和低密度脂蛋白（LDL)在血 液中转运，并由皮脂腺大量分泌。
[0150] 因为鲨烯为人体的天然组分，且是生物可降解的，其已用作疫苗佐剂的组分。这些 鲨烯佐剂之一为MF59,由Chiron开发的水包油乳剂。已在多种前临床和临床研宄中显示 MF59显著地增强针对广泛种类的疫苗抗原的免疫应答。MF59构成1997年以来在多个欧洲 国家批准的流感亚单位疫苗的一部分。该疫苗已给出了超过2千万次给药，且已显示其具 有良好的安全记录（safety prof ile)。还已通过使用来自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨 细胞病毒、单纯疱瘆病毒、人类免疫缺陷病毒、尿路病原性（uropathogenic)大肠杆菌等的 重组抗原在多个年龄组包括1至3日龄新生儿的多种调查性临床研宄显示了具有MF59佐 剂的疫苗的安全性。
[0151] 术语"有效佐剂量"或"有效量的佐剂"可为本领域技术人员充分理解，且包括能够 刺激针对施用的抗原的免疫应答的一种或多种佐剂的量，即以鼻洗出物（nasal washing) 中IgA水平、血清IgG或IgM水平或B和T细胞增殖的方式测量增加对施用的抗原组合物 的免疫应答的量。免疫球蛋白水平合适有效的增加包括与不含任何佐剂的相同抗原组合物 相比超过5 %，优选超过25 %，特别是超过50 %的增加。
[0152] 在本发明的另一个实施方案中，所述免疫制剂还可包含递送剂，其基于但并不限 于因为宿主粘多糖部分脱水、递送剂的物理性质或通过递送剂和在暴露位点的宿主组织之 间的离子相互作用（其提供储备（depot)作用）的单一或组合作用所致的液体粘性上升而 起增强抗原摄入的作用。或者，所述递送剂能够增加抗原在递送位点的停留时间（例如，延 迟抗原的排出）。上述递送剂可为生物粘着剂。在一些实施方案中，所述生物粘着剂可为 选自下组的粘膜粘着剂：糖胺聚糖（例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素软骨素、硫酸角质素、肝 素、硫酸乙酰肝素、透明质酸）、糖聚合物（例如果胶、藻酸盐、糖原、直连淀粉（amylase)、支 链淀粉、纤维素、壳多糖、水苏糖、unulin、糊精、葡聚糖）、聚（丙烯酸）的交联衍生物、聚乙 烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖（包括粘蛋白、其他粘多糖和GeISiteli，一种从芦荟植物提取 的天然酸性多糖）、聚离子化合物（polyion)、纤维素衍生物（例如，羟丙基甲基纤维素、羧 甲基纤维素）、蛋白质（例如凝集素、菌毛蛋白（fimbrial protein))和脱氧核糖核酸。在 一个实施方案中，所述疫苗制剂包含多糖如壳聚糖、壳聚糖盐、壳聚糖碱或天然多糖（例如 GelSitex )。
[0153] 壳聚糖，一种源自甲壳类外壳中的壳多糖的荷正电的直链多糖，对于上皮细 胞及覆于其上的粘液层具有生物粘着性。用壳聚糖配制抗原增加了其与鼻膜（nasal membrane)的接触时间，从而通过储备作用增加了摄入（Ilium等（2001) Adv Drug Deliv Rev, Vol.51:81-96;Illum 等（2003)J Control Release，Vol.87:187-198; Davis 等（1999)Pharm Sci Technol Today, Vol. 2:450-456 ;Bacon 等（2000) Infect Immun.，Vol. 68:5764-5770 ;van der Lubben 等（2001)Adv Drug Deliv Rev, Vol. 52:139-144 ;van der Lubben 等（2001)Eur J Pharm Sci，Vol. 14:201-207; Lim等（2001)AAPS Pharm Sci Tech, Vol. 2:20)。已对壳聚糖作为鼻递送系统对于几 种疫苗包括流感、百日咳和白喉在动物模型和人中进行了测试（Ilium等（2001)Adv Drug Deliv Rev, Vol.51:81-96;Illum 等（2003)J Control Release，Vol.87:187-198; Bacon 等（2000)Infect Immun.，Vol.68:5764-5770;Jabbal-Gill 等（1998) Vaccine, Vol. 16:2039-2046 ;Mills 等（2003)A Infect Immun，Vol. 71:726-732 ;McNeela 等（2004) Vaccine, Vol. 22:909-914)。在这些试验中，显示壳聚糖将系统性免疫应答增强至 等同于胃肠外接种的水平。此外，还在粘膜分泌中测量到显著的抗原特异性IgA水平。因 此，壳聚糖能够极大地增强鼻疫苗的有效性。而且，由于其物理特征，壳聚糖极其适于配制 为粉末的鼻内疫苗（van der Lubben等（2001)Eur J Pharm Sci, Vol. 14:201-207 ;Mikszta 等（2005)J Infect Dis，Vol. 191:278-288 ;Huang 等（2004)Vaccine, Vol. 23:794-801)〇
[0154] 在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗制剂可进一步包含药学上可接受的载 体。药学上可接受的载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，包括任何其自身不诱导对接 受该疫苗制剂的受试者有害的免疫应答产生并可在没有异常毒性情况下给药的药剂。如 本文中使用的术语"药学上可接受的"意指经联邦或州政府的管理机构批准，或列于美国药 典、欧洲药典或其他通常接受的药典以供在哺乳动物中（且更特别地，在人类中）使用。药 学上可接受的载体包括但不仅限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、灭菌的等渗水性缓冲 液及其组合。对于药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂的透彻讨论在Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. N.J.当前版本）中给出。所述制剂应适应给药模 式。在一个优选实施方案中，所述制剂适于施与人类，优选地所述制剂是无菌的、非颗粒的 和/或无热原的。所述疫苗制剂，若需要，还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或PH缓冲剂。
[0155] 在本发明的一些实施方案中，疫苗制剂包含壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖碱，等等。 所述壳聚糖的分子量可为IOkDa至800kDa，优选IOOkDa至700kDa，且更优选200kDa至 600kDa。组合物中壳聚糖的浓度通常会为高达约80% (w/w)，例如5%、10%、30%、50%、 70 %或80 %。壳聚糖优选至少为75 %脱乙酰化的，例如80-90 %，更优选82-88 %脱乙酰化 的，具体实例为83%、84%、85%、86%和87%脱乙酰化。
[0156] 本发明的组合物可配制为用于作为疫苗或抗原性制剂给药。如本文中使用的术语 "疫苗"指含有VLP或如上所述本发明的其他抗原的制剂，其为能够给予脊椎动物，并诱导足 以诱导免疫以阻止和/或缓解感染和/或减少至少一种感染症状和/或增强另一剂VLP或 抗原的效力的保护性免疫应答的形式。如本文中使用的术语"抗原性制剂"或"抗原性组合 物"指当给予脊椎动物例如哺乳动物时，会诱导免疫应答的制备物。如本文中使用的术语 "免疫应答"指体液免疫应答和细胞介导免疫应答两者。所述体液免疫应答涉及刺激B淋巴 细胞产生抗体，其例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断所述传染原的复制和/或保 护宿主细胞免受感染和破坏。所述细胞介导的免疫应答指脊椎动物（例如人）呈现的，由 T淋巴细胞和/或其他细胞如巨噬细胞介导的，针对传染原的免疫应答，其阻止或缓解感染 或减少其至少一种症状。具体而言，"保护性免疫"或"保护性免疫应答"指脊椎动物（例如 人）呈现的，针对传染原的免疫，或免疫应答的引发，其阻止或缓解感染或减少其至少一种 症状。具体而言，所述疫苗给药对保护性免疫应答的诱导彰显为胃肠炎一种或多种症状存 在的消除或减少，或上述症状的持续时间的减少或严重性的降低。因诺如病毒而起的胃肠 炎的临床症状包括恶心、腹泻、稀粪、呕吐、发热和一般性不适。减少或消除疾病症状的保护 性免疫应答会减少或停止诺如病毒爆发在人群中的扩散。疫苗制备一般地描述于Vaccine Design(〃The subunit and adjuvant approach"（eds Powell M. F. &Newman M. J. )(1995) Plenum Press New York)。本发明的组合物可配制为例如通过粘膜或胃肠外（例如肌肉内、 静脉内、表皮下、真皮内、真皮下或经皮）给药途径给予受试者。上述粘膜给药可为，但不仅 限于通过胃肠、鼻内、经口或阴道递送。在一个实施方案中，所述疫苗制剂为鼻喷剂、滴鼻剂 或干粉形式。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂为适于肌肉内给药的形式。
[0157] 本发明的疫苗制剂可为液体制剂或干粉制剂。当所述组合物意欲递送于呼吸道 (例如鼻）粘膜时，通常将其配制为水溶液以供作为气雾剂或滴鼻剂给药，或者，作为干粉 例如用于快速沉积于鼻道中。用于作为滴鼻剂给药的组合物可含有一种或多种通常包括在 该组合物中的类型的赋形剂，例如防腐剂、粘性调整剂、张度调整剂、缓冲剂等。粘性剂可为 微晶纤维素、壳聚糖、淀粉、多糖等。用于作为干粉给药的组合物还可含有一种或多种通常 包括在该组合物中的赋形剂，例如粘膜粘着剂、填充剂和用于递送适当粉末流动和大小特 征的试剂。填充剂和粉末流动和大小试剂可包括甘露醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇。
[0158] 在一个实施方案中，所述疫苗制剂含有一种或多种复合VLP作为免疫原，佐剂如 MPL?、鲨烯或MF59?，生物聚合物如壳聚糖或GelSite?以促进对粘膜表面的粘着，以 及填充剂如甘露醇和蔗糖。
[0159] 例如，疫苗可配制为含有一种或多种如本文中讨论的复合VPL如GII. 4复合VPL、 MPLfl佐剂、壳聚糖粘膜粘着剂以及作为填充剂并提供适当流动特征的甘露醇和蔗糖的 IOmg的干粉。所述制剂可包含约7. Omg(25至90% w/w范围）的壳聚糖，约I. 5mg甘露醇 (0 至 50% w/w 范围），约 I. 5mg 鹿糖（0 至 50% w/w 范围），约 25 μ g MPLli' (〇· 1 至 5% w/w范围），以及约100 μ g复合VLP抗原（0. 05至5% w/w范围）。
[0160] 复合VLP/抗原可以以约0. 01% (w/w)至约80% (w/w)的浓度存在。在一个实施方 案中，VLP可配制为约5 μ g、约15 μ g、约25 μ g、约50 μ g、约100 μ g、约200 μ g、约500 μ g以 及约 Img 每 IOmg 干粉制剂（0· 05、0· 15、0· 25、0· 5、1· 0、2· 0、5· 0 和 10. 0% w/w)的剂量以供 给药至两个鼻孔中（每个鼻孔IOmg)或约10 μ g、约30 μ g、约50 μ g、约100 μ g、约200 μ g、 约 400 yg、约 Img 和约 2mg(0. 1、0· 3、0· 5、1· 0、2· 0、4· 0、10· 0 和 20. 0% w/w)每 20mg 干粉 制剂以供给药至一个鼻孔。在每次给药过程中，所述制剂可给予一个或两个鼻孔。可在第 一次给药之后1至12周进行增强给药以促进免疫应答。疫苗和抗原性制剂中每种VLP/抗 原的含量可为1 μ g至IOOmg的范围，优选为1-1000 μ g的范围，更优选5-500 μ g，最通常为 10-200 μ g范围中。在每个剂量中给药的总VLP/抗原可为约10 μ g、约30 μ g、约200 μ g、 约250 μ g、约400 μ g、约500 μ g或约1000 μ g。总疫苗剂量可给药至一个鼻孔或分为两半 以供给药至两个鼻孔。干粉特征为少于10%的颗粒直径小于10 yrn。平均颗粒大小为直径 范围是10至500 μπι。
[0161] 在本发明的另一个实施方案中，所述干粉制剂可与一种或多种装置组合以供给予 一剂或多剂所述制剂。上述装置可为一次性使用的鼻给药装置。在另一个实施方案中，所 述一剂或多剂为单位剂量。
[0162] 在一些实施方案中，所述抗原性和疫苗制剂为液体制剂以供后续给予受试者。意 欲用于鼻内给药的液体制剂应包含复合VLP/抗原、佐剂和递送剂如壳聚糖。用于胃肠外 (例如表皮下、真皮内或肌肉内（i.m.))给药的液体制剂应包含复合VLP/抗原、佐剂和缓冲 液，而不含递送剂（例如壳聚糖）。
[0163] 优选地，本文中上述抗原性和疫苗制剂经冻干，并以无水形式储藏直至其将被使 用，在此时间点将其用稀释剂重构。或者，组合物的不同组分可分别储藏于试剂盒中（任何 或全部组分被冻干）。所述组分可保持冻干形式用于干制剂或经重构用于液体制剂，并或者 在使用前混合或者分别给予患者。对于干粉给药，所述疫苗或抗原性制剂可预加载入鼻内 递送装置并储藏直至使用。优选地，上述鼻内递送装置应保护并确保其成分的稳定性。
[0164] 本发明还涵盖包含一种或多种本文中所述的免