名志愿者跟踪安全性21天，并由独立安全监视人（Independent Safety Monitor，ISM)审查他们的安全性数据。在ISM批准之后，这些个体在第21天接受他们的 第二剂疫苗或基质，并使另外4名志愿者随机接受通过鼻内途径的5 μ g VLP蛋白加干粉基 质（η = 3)或单独的基质（n = 1)。ISM审查来自这第二组的安全性数据，并且在ISM批准 后，在第一剂后21天给予鼻内第二剂。志愿者在每次给药后记录7天症状日记。在ISM决 定放大至下一个更高剂量是可接受的之后，使另一组7名志愿者随机接受在第0天和第21 天通过鼻内途径的含有15 μ g VLP蛋白的复合VLP疫苗（η = 5)或单独的干粉基质（η = 2)。再次，记录7天症状日记，并在第21天第二剂之前由ISM审查。最后，审查来自前两个 剂量分组的安全性数据后，ISM决定剂量放大是否可接受，并且对最后一组7名志愿者随机 指派以在第0天和第21天通过鼻内途径接受含有50 μ g VLP蛋白的复合VLP疫苗（η = 5) 或单独的干粉基质（η = 2)。第21天第二剂之前ISM再次审查七天症状日记和其它安全性 数据。
[0230] 志愿者在接受复合VLP疫苗或单独的干粉基质后7天里记症状日记（包括局部症 状：诸如鼻涕、鼻疼痛/不适、鼻充血、鼻漏、鼻痒、鼻出血、头痛；和系统症状：诸如每日口腔 温度、肌痛、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻和食欲不振）。在每次随访（第7±1天、第21±2 天、第28±2天、第56±2天和第180±14天）时获得期中（interim)医学史；对志愿者询 问期中的疾病、药疗和医生出诊。要求志愿者报告所有严重的或重度的不良事件，包括在随 访期间未请求的（solicited)事件。在第7天和第28天（每次免疫后7天）对志愿者评 估CBC和血清肌酸酐、葡萄糖、AST和ALT，而且如果异常，那么跟踪异常实验室测试直至所 述测试变成正常或稳定。
[0231] 在免疫前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天和第180±14天收 集血液以通过酶联免疫吸附测定法（ELISA)测量针对复合VLP疫苗的血清抗体。在施用每 剂疫苗或单独的干粉基质之前及之后第7天收集外周血淋巴细胞以通过ELISP0T测定法检 测抗体分泌细胞。在疫苗接种之前及之后第21 ±2天、第56±2天和第180± 14天获得全 血以分离细胞并冷冻，供未来研宄由细胞介导的免疫用，包括响应复合VLP抗原而发生的 细胞因子生成，和淋巴增殖。在免疫前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2 天和第180±14天收集全便样品，供抗复合VLP SlgA筛选用。在免疫前及在第7±1天、第 21±2 天、第 28±2 天、第 56±2 天用商品化装置（Salivette, Sarstedt, Newton, NC)收集唾 液，而且如果第56天粘膜抗体呈阳性，那么收集第180± 14天样品并筛选抗复合VLP slgA。 最后，在第0天、第21天、第56天和第180天对来自接受最高剂量的复合VLP(50 μ g，上文 所述第三分组）的志愿者的血液筛选记忆B细胞。
[0232] 使用下列方法来分析自经免疫个体或接受单独的干粉基质的个体收集的血液、粪 便和唾液样品：
[0233] A.通讨ELISA测量血清抗体
[0234] 在疫苗接种之前及在疫苗接种之后多个时间点收集20mL血液以供通过ELISA测 量针对复合VLP的抗体，其中使用纯化的重组复合VLP作为靶抗原来筛选有编码的标本。 简言之，使用碳酸盐包被缓冲液PH9. 6中的复合VLP包被微滴定板。将经包被的板清洗，封 闭，并与连续两倍稀释的测试血清一起温育，接着清洗，并与酶偶联的对人IgG、IgM和IgA 特异性的二抗试剂一起温育。添加适宜的底物溶液，显色，读板，并测定IgG、IgM和IgA终 点效价，与参照标准曲线比较每种抗体类别。阳性响应定义为疫苗接种后的效价升高4倍。
[0235] B.抗体分泌细朐测宙法
[0236] 自30mL肝素化血液收集外周血单核细胞（PBMC)以供ASC测定以检测分泌针对复 合VLP的抗体的细胞。在施用所述复合VLP疫苗或单独的干粉基质后在第0日、第7±1日、 第21 ±2日和第28±2日实施这些测定。阳性应答定义为疫苗接种后每IO6个PBMC的ASC 计数超出所有受试者疫苗接种前计数的均值至少3个标准偏差（SD)(以对数计量计）和至 少8个ASC斑点，这对应于用介质刺激的阴性对照孔的均值（2个斑点）加3个SD，如相似 测定法中所测定的。
[0237] C.测量复合VLP病毒特异件记忆B细朐
[0238] 疫苗接种后在第0、21、56和180天自分组3(30mL第0天和第21天，50mL第56天 和第180天）收集肝素化血液以使用ELISpot测定法测量记忆B细胞，之前有体外抗原刺 激。相似的测定法成功地用于测量家兔中由诺沃克VLP制剂引发的记忆B细胞的频率（参 见TO 2008/042789,通过提述并入本文）。将外周血单核细胞（5xl06细胞/mL，ImL/孔，24 孔板中）与复合VLP抗原（2-10 μ g/mL) -起温育4日以使得抗原特异性记忆B细胞克隆 能够扩增并分化成抗体分泌细胞。对照包括在相同条件中在没有抗原的情况中温育的细胞 和/或与无关抗原一起温育的细胞。刺激后，清洗细胞，计数并转移至经复合VLP包被的 ELISpot板。为了测定VLP特异性记忆B细胞/总Ig分泌B淋巴细胞的频率，还将扩增的 B细胞添加至经抗人IgG和抗人IgA抗体包被的孔。用HRP标记的抗人IgG或抗人IgA， 接着用True Blue底物揭示结合的抗体。也可以使用针对IgA和IgG亚类（IgAl、IgA2和 IgGl-4)的偶联物来测定抗原特异性亚类应答，这可能与不同效应器机制和免疫引发位置 有关。用ELISpot读数器对斑点计数。通过流式细胞术为每名志愿者检查扩增细胞群以确 认他们的记忆 B 细胞表型，即 CD19+、CD27+、IgG+、IgM+、CD38+、IgD-。
[0239] D.细朐免痔应答
[0240] 作为有编码的标本收集肝素化血液（50mL分组1和2, 25mL分组3)，分离PBMC，并 在液氮中冷冻保存，以供未来可能评估针对复合VLP抗原的细胞介导免疫（CMI)应答。可 以实施的测定法包括针对复合VLP抗原的PBMC增殖和细胞因子应答，而且可以通过依照已 建立的技术测量干扰素（IFN)-y和白介素（IL)-4水平来测定。
[0241] E.收集粪便和唾液以供抗复合VLP slgA
[0242] 在粪便和唾液样品中测量抗复合VLP IgA。将唾液标本用蛋白酶抑制剂（即 AEBSF、亮抑酶肽（Ieupeptin)、苯丁抑制素（bestatin)和抑酶肽（aprotinin)) (Sigma, St. Louis，M0)处理，保存于-70°C，并使用一种先前记载的测定法的改良形式测定（Mills et al. (2003) Infect. Immun. 71:726-732)。在疫苗接种后的多个日子收集粪便，并将标本保存 于-70°C直至分析。融化标本，并添加蛋白酶抑制剂缓冲液以制备10% w/v粪便悬液。如 下所述，通过ELISA对奠便上清测定复合VLP特异性粘膜IgA。
[0243] 在疫苗接种之前及在疫苗接种之后多个时间点收集大约2_3mL的全唾液。通过 商品化装置（Salivette, Sarstedt, Newton, NC)收集唾液，其中阻嚼Salivette拭子或将 Salivette拭子在舌下放置30-45秒，直至拭子被唾液饱和。通过离心自拭子收集唾液。
[0244] F.测量粪便和唾液中的抗复合VLP
[0245] 利用用抗人IgA抗体试剂或革巴复合VLP抗原涂层包被的板实施ELISA以对每份标 本测定总IgA和滴定特异性抗VLP IgA应答。如上所述，用HRP标记的抗人IgA揭示总的 或特异性的IgA。包括一条内部总IgA标准曲线来对IgA含量定量。应答定义为特异性抗 体升高4倍。
[0246] 实施例14.两种齐1丨量的鼻内复合VLP痔苗在人中的安全件和免痔原件研究
[0247] 在健康成人中进行了一项随机化、双盲研宄以与佐剂/赋形剂和安慰剂对照（空 装置）比较两种剂量水平的复合诺如病毒病毒样颗粒（VLP)疫苗的安全性和免疫原性。所 述疫苗由实施例13中所述设计用于鼻内施用的干粉基质中的复合诺如病毒病毒样颗粒 (VLP)组成。疫苗接种者包括属于H型1抗原分泌者的健康成人志愿者。将人志愿者随机指 派四个小组之一，而且每个小组接受下列处理之一：一剂50 μ g复合VLP疫苗，一剂100 μ g 复合VLP疫苗，佐剂/赋形剂，或安慰剂。志愿者在第0和第21日给药，并被要求在每次给 药后记录7天症状日记。收集血液以供血清学、抗体分泌细胞（ASC)评估并收集粪便和唾 液样品以供粘膜抗体评估用。
[0248] 实施例13表2中列出了疫苗的成分。将疫苗包装到鼻内递送装置中。将单次施 用的复合VLP疫苗包装到单剂Bespak (MiIton Keynes, UK) UniDose DP干粉鼻内递送装置 中。每个装置递送IOmg干粉疫苗制剂。每剂疫苗由两个递送装置组成，每个鼻孔中一个。 总疫苗剂量是20mg干粉。因此，50 μ g疫苗剂量由两个装置组成，每个递送IOmg干粉制剂， 其中每IOmg干粉制剂由25yg复合VLP、25yg MPL?佐剂、7mg壳聚糖、L5mg甘露醇和 I. 5mg蔗糖组成。类似地，100 μ g疫苗剂量由两个装置组成，每个递送IOmg干粉制剂，其中 每IOmg干粉制剂由50 μ g复合VLP、25 μ g MPL?佐剂、7mg壳聚糖、I. 5mg甘露醇和I. 5mg 蔗糖组成。佐剂/赋形剂的制剂与复合VLP疫苗相同，只是制剂中不包括复合VLP抗原。佐 剂/赋形剂的制剂（也称作干粉基质）总结于实施例13表3中。安慰剂组接受两个空装 置。
[0249] 志愿者在接受两剂复合VLP疫苗、单独的干粉基质或安慰剂任一剂后7天里每天 记症状日记（包括局部症状诸如：鼻涕、鼻疼痛/不适、鼻充血、鼻漏、鼻痒、鼻出血、头痛； 和系统症状诸如：每日口腔温度、肌痛、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻和食欲不振）。在每次随 访（第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日和第180+14日）时获得期中医学史；对志 愿者询问期中的疾病、药疗和医生出诊。要求志愿者报告所有严重的或重度的不良事件，包 括在随访期间未请求的事件。在第7和第28日（每次免疫后7日）对志愿者评估CBC和 血清肌酸酐、葡萄糖、AST和ALT，而且如果异常，那么跟踪异常实验室测试直至所述测试变 成正常或稳定。
[0250] 在免疫前及在第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日和第180+14日收集血 液以通过酶联免疫吸附测定法（ELISA)测量针对复合VLP疫苗的血清抗体。在施用每剂 疫苗、单独的干粉基质或安慰剂前及在施用每剂疫苗、单独的干粉基质或安慰剂后第7日， 收集外周血淋巴细胞以通过ELISP0T测定法检测抗体分泌细胞。在疫苗接种之前及在疫苗 接种后第21+2日、第56+2日和第180+14日，获得全血以分离细胞并冷冻，供未来研宄由细 胞介导的免疫用，包括响应复合VLP抗原而发生的细胞因子生成，和淋巴增殖。在免疫前 及在第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日和第180+14日收集全便样品，供抗复合 VLP SlgA筛选用。在免疫前及在第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日用商品化装置 (Salivette, Sarstedt, Newton, NC)收集唾液，而且如果第56日粘膜抗体呈阳性，那么收集 第180+14日样品并筛选抗复合VLP slgA。还在第0、21、56和180日对血液筛选记忆B细 胞。
[0251] 用于分析自经免疫个体或接受单独的干粉基质或安慰剂的个体收集的血液、粪便 和唾液样品的方法详细记载于实施例13中。
[0252] 实施例15.用感染件诺如病毒在用复合诺如病毒VLP痔苗接种之后讲行的实骀件 对人攻击研究
[0253] 在80名用所述复合诺如病毒VLP疫苗免疫的人志愿者中进行了一项多部位、随机 化、双盲、有安慰剂对照的1-2期攻击研宄。合格的受试者包括那些年龄为18-50岁的，健 康状况良好的，表达H型-寡糖1的（通过阳性唾液分泌者状态来测量）且不属于B型或 AB型血的。属于非H型-1分泌者的或具有B或AB型血的受试者据报告对诺沃克病毒感染 更有抵抗力，被排除在研宄之外。基于这两条标准，预期至少80%的志愿者是合格的。
[0254] 筛选后，将达到所有接受标准的合格志愿者随机（1:1)分入两个同等大小的分组 之一，每个分组中有约40名志愿者。分组1用复合VLP免疫而分组2接受安慰剂。在每个 鼻孔中用IOmg复合VLP疫苗（总共20mg干粉）或安慰剂免疫志愿者。每IOmg复合VLP 疫苗含有50yg复合VLP、7mg壳聚糖、25yg MPL?、1.5mg蔗糖和约1.5mg甘露醇。如 此，分组1中的每名志愿者在每次免疫时接受100 μ g复合VLP抗原的总剂量。志愿者在第 0和第21日接受疫苗或安慰剂。
[0255] 评估了复合病毒VLP疫苗与安慰剂相比的安全性。志愿者在每次用疫苗或安慰剂 免疫后7日里记日记以记录不良事件的严重程度和持续时间。最后一剂疫苗或安慰剂后6 个月里和用感染性病毒考验后的4个月里跟踪严重的不良事件（SAE)和任何重大新医学状 况的发生。
[0256] 在第二剂疫苗或安慰剂后21-42日之间（研宄第42-56日之间）用感染性诺如病 毒考验所有志愿者。每名志愿者接受大于或等于50%人感染剂量（HID 50)，即预期在安慰 剂组的至少50%的志愿者中引起疾病的感染性病毒量。HID 50介于约48和约480病毒当 量的攻击病毒株之间。将攻击诺如病毒与无菌水混合，并口服给药。接种之前摄取水中的 500mg碳酸氢钠，以防止病毒被胃酸和胃蛋白酶分解。在口服接种感染性病毒后5分钟进行 第二次碳酸氢钠溶液（水中的500mg碳酸氢钠）摄取。志愿者在考验机构逗留至少4天且 在急性胃肠炎的症状/体征（呕吐、腹泻、稀粪、腹痛、恶心和发烧）消失后至少18小时。
[0257] 监测数项度量来测定复合VLP疫苗在预防或减轻由病毒考验诱发的急性胃肠炎 的症状/体征方面的效能。记录所有志愿者的急性胃肠炎临床症状，而且研宄人员在研宄 场所将这些症状记入文件。将来自接受疫苗的分组1的疾病症状/体征与分组2安慰剂接 受者比较。
[0258] 在用疫苗或安慰剂免疫前和在考验后例行地自所有志愿者收集血清和粪便样品。 通过ELISA分析血清样品的IgA和IgG，针对攻击VLP的效价。分别通过ELISA和PCR在粪 便样品中测试攻击病毒抗原和攻击病毒RNA，其指不病毒的存在、自肠脱落的病毒的量和病 毒脱落的持续时间。对在考验后生病的受试者进行别的实验室研宄，包括血清化学、BUNJA 酸酐和肝功能测试，直至症状/体征得到解决。
[0259] 比较来自疫苗组（分组1)和安慰剂组（分组2)的结果以评估疫苗针对诺如病毒 疾病总体的保护效能（主要终点）和/或其在改善症状/体征（疾病的严重程度和天数） 和/或病毒脱落的存在、量和/或持续时间的降低中的效能（次要终点）。
[0260] 本发明在范围上不受所描述的具体实施方案的限制，所描述的具体实施方案意欲 作为本发明各方面的单一例示，而且功能上等同的方法和成分在本发明的范围内。实际上， 根据上述描述和附图，仅使用例行实验，在本文所显示的和所描述的那些之外，对本发明的 各种修饰对于本领域技术人员而言即会变得显而易见。上述修饰和等同方案意欲落在所附 权利要求的范围内。
[0261] 通过提述将本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请并入本说明书，其程 度有如具体并单独指明通过提述将每一篇单独的出版物、专利或专利申请并入本文一样。
[0262] 本文中对参考文献的引用或讨论不应解释为承认其为本发明的现有技术。
【主权项】
1. 一种病毒样颗粒，其包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基 酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述至 少一种多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒并且与所述两种或更多种流行株的各 个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。2. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒具有所述无包膜病毒的两种或更多 种流行株的抗原性质。3. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒在与所述无包膜病毒的一种或多种 流行株的抗血清交叉反应性方面与通过用仅含有来自所述一种或多种流行株的蛋白质的 病毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比增加至少两倍。4. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行 株的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。5. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行 株的衣壳序列相比含有至少5个不同的氨基酸。6. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行 株的衣壳序列相比含有至少9个不同的氨基酸。7. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述共有序列是SEQIDNO:2。8. 权利要求1的病毒样颗粒，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒 (Calicivirus)、小RNA病毒（Picornavirus)、星状病毒（Astrovirus)、腺病毒 (Adenovirus)、呼肠孤病毒（Reovirus)、多瘤病毒（Polyomavirus)、乳头瘤病毒 (Papillomavirus)、细小病毒（Parvovirus)和戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus)。9. 权利要求8的病毒样颗粒，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。10. 权利要求9的病毒样颗粒，其中所述杯状病毒是诺如病毒（Norovirus)或札幌病毒 (Sapovirus)〇
【专利摘要】本发明提供了交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒。本发明提供具有复合氨基酸序列的多肽，所述序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。具体而言，本发明提供了包含至少一种复合多肽的病毒样颗粒。上述病毒样颗粒具有无包膜病毒的两种或更多种流行株的抗原性表位，并使得与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的抗血清交叉反应性增加。还公开了制备复合病毒样颗粒和包含复合病毒样颗粒的疫苗制剂的方法。
【IPC分类】C12R1/93, C12N7/04
【公开号】CN104911154
【申请号】CN201510127943
【发明人】查尔斯·理查森, 罗伯特·巴加策, 乔尔·海恩斯, 布赖恩·斯特德曼
【申请人】武田疫苗股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2009年8月10日
【公告号】CA2733589A1, CN102177233A, CN102177233B, EP2324113A1, EP2324113A4, US8841120, US20110195113, US20150023995, WO2010017542A1