限；由于Ca 2+来源较广，优选地，二价 金属离子为钙离子，且二价金属离子盐溶液为CaCl2溶液，CaCl 2的浓度为1% -5% W/V，钙 离子浓度越大，凝胶球直径越大，形成的孔隙结构越多，凝胶球的渗透能力也越强，越有利 于细胞附着生长、分化；海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钙等，优选为海藻酸钠溶液，海藻酸 钠的浓度为2% -10% W/V。本发明中单位W/V如无特别指出均为mg/ml。
[0031] 需要注意的是，由于二价金属离子和海藻酸盐的反应迅速，可通过提高凝胶化温 度，钙离子总量或降低海藻酸盐溶液浓度来加快胶化过程；而减慢固化速度、提高海藻酸盐 溶液浓度、钙离子总量以及使用分子质量较高的海藻酸盐，可以增强其力学性能，更有利于 间充质干细胞的分化。另外，海藻酸盐与金属离子盐溶液的滴加顺序及滴加速度会影响胶 体的性质，滴加速度过快，产生的胶体是小片状凝胶和间断的凝胶结构，间充质干细胞分布 不均匀；优选地，本发明采用将间充质干细胞与海藻酸盐混合后匀速滴入金属离子盐溶液 中，以此形成的凝胶球大小较均匀，也不会影响间充质干细胞在胶体内的均匀分布。
[0032] 在本发明中，先将磁性氧化物与海藻酸盐混合均匀，再加入间充质干细胞，当加入 二价金属离子盐溶液之后，可将磁性氧化物和间充质干细胞均匀包裹在海藻酸凝胶球内； 然后，海藻酸凝胶球在外加磁场的作用下进行一定的运动。海藻酸凝胶球为间充质干细胞 提供了三维生长空间，而磁性氧化物通过与外加磁场的配合也为间充质干细胞提供一个动 态培养环境，以模拟人体内细胞动态生长的环境，从而可促进间充质干细胞的增殖分化，并 提尚细胞活性。
[0033] 优选地，磁性氧化物颗粒的直径为l-100nm纳米级，直径过大会影响海藻酸凝胶 球的包覆，直径太小也会影响磁运动强度；磁性氧化物可以是Fe 304或Co 304。由于Fe304来 源较广泛，因此优选选用Fe 304，且Fe304的浓度为2-10mg/ml。
[0034] 步骤三中，待凝胶球形成之后，去除多余的二价金属离子盐溶液，并用NaCl溶液 反复清洗，再用基础培养基清洗，避免金属离子在细胞培养过程中产生毒性作用；然后，再 将含有间充质干细胞和磁性氧化物的凝胶球置于外加磁场中进行动态诱导培养，优选地， 采用强力磁铁作为外加磁场，且强力磁铁的最大磁能积为35MG0e。动态培养条件剪切应力 在某种程度上能够促进间充质干细胞形成软骨细胞，提高诱导转化率。
[0035] 进一步地，诱导培养过程中，本发明所采用的诱导剂中包括TGF-P、地塞米松、抗 坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix。
[0036]其中，TGF-0 (transforming growth factor-0，TGF-0 转化生长因子)是 一族广泛存在、结构相关、功能相似的多功能活性肽，具有多种功能的多肽生长因子，可以 促进间充质干细胞的增殖与分化，促进细胞外基质的合成，促进胶原产生，刺激软骨细胞的 合成与分泌细胞外基质蛋白，促进骨细胞的增殖。TGF-P有三种异构体，分别为TGF-P1、 0 2和0 3, TGF-P 2、0 3较0 1可更快速有效地促进间充质干细胞向软骨细胞分化，但 TGF-P 2、0 3之间诱导干细胞的水平基本相同。由于TGF-P在骨生长中的生物学功能呈双 向调节作用，既能刺激细胞的增殖分化作用，也能进行抑制作用，一般来说，低浓度TGF-0 起刺激作用，促进细胞的增殖分化；高浓度起抑制作用，因此，优选地，TGF-P的浓度为 5-15ng/ml〇
[0037] 地塞米松，购于Sigma公司，能够刺激碱性磷酸酶、骨钙素和I型胶原等的表达， 显著地增加碱性磷酸酶的活性，碱性磷酸酶是骨形成过程中必须的酶，碱性磷酸酶的表达 情况代表着骨形成的状况，可以激活位于间充质干细胞表面的糖皮质激素受体，促进间充 质干细胞向软骨细胞分化，同时，提高间充质干细胞向软骨细胞的分化率；优选地，地塞米 松的浓度为7-10mmol/ml。
[0038] 抗坏血酸又称维生素C，是水溶性维生素的一种，参与氧化还原过程，在生物的氧 化和还原过程以及细胞呼吸作用中扮演重要角色，同时，抗坏血酸是胶原合成所必需的，还 可调节ATP酶与ALP活性及非胶原基质蛋白质的合成；抗坏血酸对软骨细胞分化的促进 作用，主要是通过增加胶原的累积，然后增加碱性磷酸酶在软骨细胞中的表达；此外，作为 一种抗氧化剂还可抑制或减少诱导过程中细胞凋亡的产生。优选地，抗坏血酸的浓度为 50-100ug/ml〇
[0039] 甘油磷酸钠可以为软骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙 化，是骨髓基质间充质干细胞产生矿化结节的必要条件；优选地，甘油磷酸钠的浓度为 5-15mmol/ml〇
[0040] ITS+Premix作为一种生长因子加进基础培养基，购于BD公司，其成份包含有牛血 清白蛋白和亚油酸等，能够促进细胞的增殖生长；优选地，ITS+Premix的浓度为50-150ng/ ml 〇
[0041] 进一步地，本发明提供的诱导液还包括胰岛素和转铁蛋白；胰岛素可降低蛋白质 降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，为细胞生长和分化提供能量，促使间充质干细胞处于 低糖环境，保持细胞活性，有利于间充质干细胞向软骨细胞的分化，优选地，胰岛素的浓度 范围为5-10mg/ml ;而转铁蛋白能够干预软骨细胞内离子代谢，促进软骨细胞的生成，优选 地，转铁蛋白的浓度范围为5-10mg/ml。
[0042] 更进一步地，本发明提供的诱导液还包括谷氨酰胺，谷氨酰胺参与蛋白质的合成 和核酸代谢，可作为诱导液中的能量来源，另外，谷氨酰胺通过细胞增容作用，也可促进细 胞的生长和分化；优选地，谷氨酰胺的浓度范围为1-10_〇1/1。
[0043] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0044] 实施例1
[0045] 本发明提供的间充质干细胞的三维动态诱导培养方法，包括以下步骤：
[0046] 1、间充质干细胞的分离；
[0047] 将空气注入新西兰大白兔耳缘静脉，使其死亡。用75%的酒精涂抹大白兔的四肢， 消毒并减少兔毛的污染。剪下兔四肢的股骨和腔骨，除去皮肤组织保留关节处的肌肉结缔 组织，其余部位的肌肉组织剪去。将处理过的组织浸泡在75%的酒精，30min之后取出，用 无菌PBS清洗，放置在超净台中。用无菌手术刀切掉关节处的肌肉，使关节暴露。用骨剪剪 开关节，使骨腔暴露。使用一次性注射器吸取无菌PBS，反复冲洗骨腔，使骨腔内的骨髓都 冲洗到一次性平皿中。将液体转移至无菌的200目的筛网上，过滤除去大组织，获得悬浮 液。将悬浮液缓慢加入到事先装有15ml的Ficoll淋巴分离液的50ml离心管，2790rpm离 心30min。离心结束后，用尖吸管吸取液体中间白色雾状层细胞，将细胞转移至T150大方瓶 后，加入50ml间充质干细胞生长培养基，3天后换液。待细胞融合度达到90%后传代，胰酶 消化3-5min，吸取悬浮液转移至新的方瓶中培养，此细胞记为P2细胞，部分冷冻保存，其余 部分继续传代。
[0048] 2、间充质干细胞的传代培养，获取P3代间充质干细胞；
[0049] 细胞融合度达到90 %左右时即可消化传代，吸出培养基，用无菌PBS清洗细胞表 面，洗去残留的培养基。加入5ml胰酶，静置5min，显微镜观察多数细胞变为球形，可以浮动 时，加入含有FBS的培养基终止消化。吸出细胞悬液，血球计数板计数，再以1.