14化-15与C-30化-11与C-9 ; H-Ila与C-8W及&-19与C-9的相关性验证了 30, 9-运个官能团的连接关系。综合氨谱、 碳谱、HMBC谱和NOESY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所 示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[002引实施例2 :化合物（I)药理作用试验
[0027] 一、材料和仪器
[0028]HepG2人肝癌细胞株购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。L02正常人肝细 胞株由复旦大学中山医院肝癌研究所馈赠。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%。 RPMI-1640培养基、膜酶购自Gibco公司。标准小牛血清购自Biowest公司。3-(4,5-二甲 基嚷挫-2)-2,5-二苯基四氮挫漠盐曲1'1')、二甲基亚讽〇^50)、台吩蓝灯巧口曰址山6)、二氯 巧光素双醋酸盐值CFH-DA)均购自上海国药集团化学试剂有限公司。其他常用试剂均为分 析纯。
[0029] 微量天平（瑞±梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通台式离屯、机（上海 安亭科学仪器厂）。数显电热恒溫水浴箱（上海跃进医疗机械厂，皿.W21.600巧。二氧 化碳细胞培养箱（美国化rmaScientific公司）。高速冷冻离屯、机（美国Thermo公司， IECMICROMAXRF)。超微量紫外分光光度计（美国IliermoHsher公司，NanoDrop-1000 )。 紫外成像系统（上海复日科技有限公司，FR-200A)。酶联免疫检测仪，巧光分光光度计 化itachiF2500)。
[0030] 二、试验方法 [00引]1、细胞培养
[0032] 将细胞常规接种于含10% (体积分数）小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于 37°C、5%C〇2浓度的培养箱中培养。
[0033] 2、化合物（I)干预培养液的配置
[0034] 将45. 44mg化合物（I)溶于10血二甲基亚讽（DMSO)制得储备液并分别稀释2 倍、4倍，分别得到2mmol/l、4mmol/L及8mmol/L的化合物（I)应用液。进行细胞干预前， 将50yL应用液与4950yL常规培养液（含10 %体积分数的小牛血清）充分混合，得到化 合物（I)干预培养液（2〇ymol/l、40ymol/l、8〇ymol/L)。
[003引 3、MTT法检测细胞存活率
[0036] 取对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔200yL巧XIO3细胞）。培养1化待 细胞贴壁后，弃去原培养液，加入200yL不同浓度的化合物（I)培养液值MSO溶解化合物(I)后W1%体积分数与常规培养液混合，使化合物（I)终浓度为20ymol/l、40ymol/ L80ymol/L)，每组6个平行孔。同时设6个溶剂值MS0)对照孔。培养2地、4她、72h，每 24小时更换化合物（I)干预培养液。干预结束后，吸去培养液，向各孔加入20yLMlT溶 液，37°C解育4h后吸去各孔上清液，加入150yLDMSO,置摇床上低速震荡lOmin，待结晶充 分溶解后，WDMSO调零，用酶联免疫检测仪在490nm处测定各孔吸光度，计算细胞存活率 (survivalrate，SR)。SR=实验组A49。/ 对照组AasqX100%
[0037] 4、台吩蓝染色測定存活细胞数
[003引将相同数量（2X106)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后，弃 去培养液，用PBS洗细胞两遍后，加入5mL的化合物（I)干预培养液（20ymol/l、40iimol/ L80iimol/L)。每组S瓶细胞，同时设立S瓶溶剂值MS0)对照。培养4化后，用0. 25%膜 酶消化细胞，收集细胞悬液，台吩蓝染色测定细胞数。
[0039] 5、DCFH-DA法测定细胞内ROS活性
[0040] 将相同数量（2X106)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后， 吸去原培养液，加入5mL化合物（I)干预培养液，继续培养4化后，弃去培养液，膜酶消 化细胞，收集细胞悬液于1. 5血EP管中，150化pm离屯、5min，弃上清，向沉淀中加入1血 DCFH-DA，吹打混匀，37°C解育30min，加入PBS终止反应，离屯、收集沉淀并溶解于1血PBS， 吹打成均匀细胞悬液，用Hitachi-F2500焚光分光光度计测定巧光值。激发波长488nm，发 射波长525nm。
[0041] S、结果及结论
[004引 1、细胞生长存活率
[0043] 胎pG2细胞经化合物（I)干预培养2地、4她、7化后，低、中、高剂量组的细胞存活 率均显著低于溶剂对照组（P<〇. 05)，且细胞存活率下降的程度与化合物（I)干预浓度之 间存在一定剂量效应趋势（表1，平<0. 05VS对照组；bp<〇. 05VS低剂量组；平<0. 05VS中剂量 组）。在同一化合物（I)干预浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现下降的趋 势。而同等条件下，L02人正常肝细胞经化合物（I)干预后，细胞存活率无显著变化（表 2)。台吩蓝染色细胞计数结果与MTT-致（图3,平<0. 05VS对照组；bp<〇. 05VS低剂量组； 平<0. 05VS中剂量组）。
[0044] 2、细胞内ROS活性
[0045] 胎pG2人肝癌细胞经不同浓度化合物（I)干预后，与对照组相比，细胞内ROS水 平显著下降（P<〇. 05)。结果见表3 (平<0. 05VS对照组；bp<〇. 05VS低剂量组）。
[0046] 结论，采用不同浓度的化合物（I)对人肝癌细胞化pG2进行干预处理，经MT比 色及台吩蓝染色细胞计数表明，化合物（I)能够有效抑制化pG2细胞的生长增殖，干预组 细胞的存活率较对照组显著降低，且降低程度与化合物（I)浓度呈现一定的剂量效应趋 势，同时在同一化合物（I)浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现持续降低的趋 势。与此同时，相同剂量的化合物（I)干预对L02正常肝细胞并不产生抑制作用。
[0047] 表1化合物（I)对胎pG2细胞生长存活率的影响（X+S，n= 6)
[0048]
[0049] 表2化合物（I)对L02细胞生长存活率的影响（x±s，n=6)
[0052] 表3化合物（I)对胎pG2细胞ROS水平的影响（X+S，n= 6)
[0053]
[0054] 实施例3
[0055] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[005引 实施例4
[0057] 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0058] 实施例5
[0059] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0060] 实施例6
[0061] 注射液的制备：按实施例I方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[00的]实施例7
[0063] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无菌 烙封得粉针剂。
[0064] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a)将 灯台树的干燥叶粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步 骤（b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30 :1、10:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤 (d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等 度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，用80%乙 醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的 化合物（I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗肝癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的三萜化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的三萜类化合物，可以从灯台树的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，干预组细胞的存活率较对照组显著降低，且降低程度与化合物(Ⅰ)浓度呈现一定的剂量效应趋势。化合物(Ⅰ)在治疗肝癌方面具有潜在的应用价值，可以用来开发成治疗肝癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61P1/16, C07J71/00, A61K31/585
【公开号】CN105218617
【申请号】CN201510640790
【发明人】宋晓梅
【申请人】宋晓梅
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月30日