商所建议的条 件实施检测。
[0028] 实施例1样本的采集及测序
[0029] 对照组：收集2012-2014年因交通事故在医院进行半月板损伤及交叉初带损伤进 行关节镜手术治疗的患者，取膝关节软骨组织速存于液氮罐。
[0030] 骨性关节炎患者组：收集2012-2014年在医院就诊，根据1995年美国风湿协会骨 性关节炎的诊断标准，诊断为重度骨性关节炎，有膝关节置换指征的患者病例。
[0031] 其中，临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准：
[0032] (1) 1个月内大多数时间有膝痛；
[0033] 似关节活动时响声；
[0034] (3)晨僵不大于30分钟；
[0035] (4)年龄不小于40岁；
[0036] (5)膝关节骨性肿胀伴弹响；
[0037] (6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。
[003引最少存在（（1)、似、（3)、（4)或（1)、似、（3)、妨或（1)、（6)即可诊断0A。
[0039] 样品采集后，选择5例患者组2例对照组送往美吉生物公司进行转录组测序和全 基因组甲基化测序，并提供初步的分析结果。测序结果显示候选基因KIFlC在骨性关节炎 患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于 正常组。
[0040] 实施例2骨性关节炎患者及对照滑膜组织KIFlC基因表达情况
[0041] 1.实验材料
[0042] 选取37例骨性关节炎患者滑膜组织及9例对照滑膜组织，对其进行分组及编号。 病例组均符合膝关节OA诊断标准，进行膝关节置换手术患者；对照组为半月板损伤及交叉 初带损伤进行关节镜手术治疗的患者。
[004引 2.实验方法
[0044] 2. 1骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取
[0045]采用TRI/ol]iReagent(invitrogen，货号 15596-018)进行样本RNA提取，实验操 作按产品说明书进行。
[0046]RNA质量判定标准：RNA样本的0D260/0D280值为1. 7-2. 2之间；总RNA电泳图谱 有清晰的28SU8S条带；70°C水浴保溫1小时后的电泳图谱与水浴保溫前的图谱无明显差 异。
[0047] 2. 2逆转录合成cDNA
[0048]采用S叩t;r敲rip媽IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0049] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1yg总RNA进行逆反录合成cDNA。
[0050] 采用25y1反应体系，每个样品取1yg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存 放-20°C冰箱备用。
[0051] 2. SReal-Time PCR
[0052] 引物设计
[0053]采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_006612. 5化IFlC)，内参选 GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
[0054]表 1Real-Time PCR引物序列
[00巧]
[005引操作过程如下：
[0057]( 一）反应体系：用F*owerSYB裝發GreenPCRMasterMix(invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°C5min预反应，进行40 个循环（95°C15s，60°C45s)的扩增反应。
[0058]表 2Real-Time PCR反应体系
[0059]
[0060](二）引物筛选
[0061] 将各样本CDNA混合后，W此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2 y1作模 板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95°C进行融解曲线分析，根 据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
[0062] (S)样品Real-Time PCR检测
[006引将各样品CDNA 10倍稀释后取2 y 1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物 进行扩增。同时在60-95°C进行溶解曲线分析。
[0064] 3.实验结果
[0065] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增 效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物 溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公 式，比较KIFlC基因在骨性关节炎组和对照组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果 稳定，其KIFlC基因在骨性关节炎组中的表达水平为对照组织的约0. 37倍，W上结果验证 了高通量转录组表达数据的整合分析KIFlC基因在骨性关节炎患者中低表达的结果。
[0066] 实施例3DNA的提取及甲基化修饰
[0067] 1.酪-氯仿抽提法处理DNA
[006引基因组DNA提取采用酪-氯仿抽提法，详细步骤如下：
[0069] (1)取0.Ig软骨组织置于研磨中，加入液氮进行快速研磨，待研磨至粉末状时候， 将其转入是离屯、管中，并加600y1消化缓冲液，再加4y1蛋白酶K(IM)，摇匀后置于55°C 水浴中至消化清透；
[0070] (2)用等体积的重蒸饱和酪，混匀，摇床慢速摇动20min，1000 Og离屯、lOmin，取上 清液；
[0071] (3)加氯仿/异戊醇（24:1)酪：抽提液=1:1:2,混匀，摇床慢速摇动20min，离屯、 后取其上清液；
[0072] (4)加氯仿/异戊醇（24:1):抽提液==1: 1，混匀后再次离屯、取其上清液；
[007引妨加0.1倍体积醋酸钢（3M，抑=5.。和2倍体积冰冻的无水乙醇，混匀，冷冻 过夜；
[0074]化)4°C，12000g离屯、15min弃上清液；
[00巧](7)沉淀用500y1冰冻的70%乙醇充分洗涂，12000g离屯、5min，弃上清液；
[0076] (8)重复执行步骤7,室溫下自然惊干；
[0077] (9)用30-50y1双蒸水充分溶解沉淀，琼脂糖电泳检测DNA的完整性，-20°C冻存 备用。
[0078] 2.DNA样品的修饰及纯化：
[0079]DNA甲基化的修饰是采用EZDNAMethylatiorTKit狂YMORESEARCH,货号D5002) 进行，原理和经典的亚硫酸氨钢修饰基本相似。经试剂盒处理后，甲基化的胞喀晚未发生变 化，而未发生甲基化的胞喀晚（C)都将变成尿喀晚扣）。再设计分别针对甲基化和非甲基化 序列的特定引物，进行PCR的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析的方法来确定DNA的甲基化状 态变化。
[0080] 具体步骤：
[00引](I)DNA的准备：将之前提取的DNA双蒸水稀释至25-100iig/ml后吸取20ii1置 于PCR管中；
[0082]似CT转化试剂（ConversionReagent)的制备：一个CT转化试剂管中添加 900y1水，300y1的M-稀释缓冲液和50y1的M-溶解缓冲液，室溫下溶解并震荡IOmin; [008引（3)将130y1CT转化试剂、20y1DNA样品添加至PCR管中，若DNA样本体积不 足20y1，可用去离子水补足差量，通过移液枪或者轻弹试管等操作混合样品；
[0084] (4)把样品放到循环变溫器中，先于98°C放置10分钟，再于64°C放置2. 5小时后， 马上进行一下步骤；
[00财 妨将600y1的M-结合缓冲液添加到幻mo-Spin1C?吸附柱中，并将吸附柱放 到收集管中；
[008引 （6)在含有M-缓冲液的幻mo-Spin1C?吸附柱中加入步骤（4)中的样品，封盖后 混匀样本；
[0087] (7)经30秒全速离屯、后去掉流出液；
[008引做将100y1M-漂洗缓冲液添加到吸附柱中，并全速离屯、30秒；
[008引 （9)将200y1M-硫化缓冲液添加到吸附柱中，于室溫下放置20分钟，培养后全速 离屯、30秒；
[0090] (10)将200y1M-漂洗缓冲液添加到柱中，全速离屯、30秒后再添加200y1M-漂 洗缓冲液到柱内，再次全速离屯、30秒；
[00川 （11)直接将10y1M-洗脱缓冲液添加到柱中，将吸附柱放置在1. 5ml的EP管内， 全速离屯、洗脱DNA;
[009引（。）重复执行步骤11，EP管内即为所修饰和纯化的DNA ;
[0093] (13)DNA储存在-70°C冰箱中备用。
[0094] 实施例4KIF1C基因甲基化CpG位点的研究
[009引37例骨性关节炎患者滑膜组织及9例对照滑膜组织按照实施例3中方法提取DNA 并进行了样品的修饰及纯化，即甲基化的胞喀