组NS1蛋 白的反应性结果；
[0020] 1 :感染12型BTV的BHK-21细胞沉淀；2:未感染BTV的BHK-21细胞沉淀；3:真 核重组NS1蛋白；Μ:蛋白marker
[0021 ] 图5为原核表达的55条MBP融合短肽SDS-PAGE分析；
[0022] Μ:蛋白质分子量标准；1-55 :表达的55条融合短肽pNSl-Ι~pNSl-55。
[0023] 图6为利用间接ELISA法鉴定BTVNS1蛋白的线性B细胞表位分析；
[0024] 图7为原核表达的pNSl-46与BTV-NS1-1F11反应性的Westernblot鉴定。
[0025] Μ:标准蛋白Marker;1 :BTV-NS1-1F11与真核表达的重组NS1蛋白的反应；2 : BTV-NS1-1F11 与空载体pMAL-c4x的反应；3 :BTV-NS1-1F11 与pNSl-46 的反应。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0027] 主要实验材料和来源
[0028] 1.蛋白、细胞、毒种
[0029] pET_30a原核表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白、Bac-to-Bac杆状病毒真 核表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白，SP2/0细胞、Sf21细胞，NS1蛋白截短表达的 55条MBP融合短肽均由本实验室保存。
[0030] 2.主要试剂和药品
[0031] 胎牛血清（FBS)购自HYCL0NE公司、DMEM购自GIBC0L公司；弗氏佐剂、50 %PEG、 50XHAT、50XHT和8-氮鸟嘌呤（8-AG)和异硫氰酸荧光素（FITC)标记山羊抗小鼠IgG 均购自Sigma公司；辣根过氧化物酶（HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为金桥生物技术有限 公司进口分装产品；SBAClonotyping?System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司；快速连接试剂盒、pMAL?ProteinFusionandPurificationSystem 融合蛋白表达与纯化试剂盒购自NewENGLANDBiolabs(NEB)公司；PremixExTaqHS、DNA Marker、限制性内切酶BamHI和Hindlll购置于TaKaRa公司；抗6XHis标签的单克隆抗体 购自Roche公司；Ni2+NTA树脂购自Novagen公司。CellfectinReagent购自Invitrogen 公司。
[0032] 3.实验动物
[0033] 8周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
[0034] 实施例1BTV12-NS1蛋白的原核与真核表达及纯化
[0035] 1.引物设计
[0036] 原核表达采用pET_30a原核表达系统，根据本实验室保存的BTV12-NS1基因序列 (GenBank登录号：ADD62093. 1)设计PCR扩增引物：
[0037] pET-BTV12-NSl-l-22F：
[0038] 5 '-GCGGATCCATGGAGCGCTTTTTGAGAAAAT-3 '(BamHI);
[0039] pET-BTV12-NSl-1659-1640R：
[0040] 5 '-ACGAAGCTTGATACTCCATCCACATCTGCGAC-3 '(HindIII)。
[0041] 真核表达采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，按照上述序列分别设计PCR扩 增引物：
[0042] pF-BTV12-NSl-l-22F：
[0043] 5,-GCGGATCCGATGGAGCGCTTTTTGAGAAAAT-3,（BamHI);
[0044] pF-BTV12-NSl-1659-1635R：
[0045] 5,-ACGAAGCTTCTAATACTCCATCCACATCTGCGAC-3,（HindIII)。
[0046] 2.BTV12-NS1蛋白的重组原核表达载体构建及NS1蛋白的原核表达与纯化
[0047] 首先PCR扩增BTV12NS1基因，将获得的目的片段进行胶回收，分别将回收产物和 原核表达载体pET-30a进行BamHI、HindIII双酶切。将纯化后的酶切产物25°C连接5min， 转化至E.coliDH5a感受态细胞中，37°C恒温倒置过夜培养。随机挑取大小均匀的单菌 落接种于5mLLB液体抗性培养基（Kan+100yg/mL)中，37°C过夜摇床培养。提取重组质粒 进行初步筛选，空载体pET-30a作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双酶切与PCR鉴 定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序，测序正确的重组质粒命名 为PET-BTV12-NS1。
[0048] 将测序正确的重组质粒pET-BTV12-NSl转化至E.coliBL21感受态细胞中，37°C 过夜培养后，随机挑取单菌落，接种于5mLLB液体培养基（100yg/mLKan+)中37°C过夜培 养，取lmL新鲜菌液加入到100mL(100μg/mLKan+)LB培养基中37°C培养至0D6QQnni约为0. 5 时加入终浓度为1.Ommol/L的IPTG，37°C诱导6h。菌体4度离心后进行超声裂解，分别收 集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，发现重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀中。由于原核表 达载体pET-30aN和C端均携带6XHis标签，所以使用Ni2+NTA树脂对其进行变性纯化，结 果只有一条特异性的条带出现在70kDa左右（图1)，与重组NS1蛋白的分子质量相符，蛋白 浓度可达2mg/mL。利用HRP标记的抗6XHis标签单克隆抗体进行Westernblot鉴定，表 明NS1蛋白纯化成功。
[0049] 3.BTV12-NS1蛋白的重组真核表达载体构建及NS1蛋白的真核表达与纯化
[0050] 首先PCR扩增BTV12NS1基因，将目的产物进行胶回收，回收获得的片段与杆状病 毒的穿梭载体pFastBaC?HTA分别进行双酶切。将纯化后的酶切产物利用快速连接试剂盒 25°C连接5min后连接产物转化至E.coliDH5α，37°C恒温倒置过夜培养。随机挑取单个 菌落，分别接种到5mLLB液体抗性培养基（Amp+100yg/mL)中，37°C过夜培养。提取重组 质粒进行初步筛选，空载体pFastBaC?HTA作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双酶切 与PCR鉴定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序，测序正确的重组 质粒命名为pFast-BTV12-NSl。
[0051] 将测序正确的重组质粒pFast-BTV12_NSl按照说明书转化感受态细胞E.coli DHlOBac?。首先将-80°C保存的50μL感受态细胞DH10Bac?(100μL)置于冰上，待融化时 加入1μL重组质粒pFast-BTV12-NSl，混匀后冰浴30min，42°C热激60s，冰浴5min，在超净 工作台内向混合物中加入室温的无抗生素的S0C液体培养基900μL，37°C震荡培养4h。将 上述菌液分别做10倍、100倍、1000倍稀释后各取100μLLA-Bac平板（LA-Bac平板即含 Kan+50μg/mL、庆大霉素 7μg/mL、四环素 10μg/mL、X_gal100μg/mL和IPTG40μg/mL的 LB固体培养基）上，37°C恒温倒置培养48h，然后进行蓝白斑筛选。随机挑选单个白色菌落 划线培养接种到新的LA-Bac平板上做3次纯化鉴定，方法同上。当LA-Bac平板上菌落均为 大小均勾的白色菌落时，随机挑取一个菌落分别接种至5mL含50μg/mLKan+、7μg/mL庆大 霉素、10μg/mL四环素的LB液体培养基中，同时挑取蓝色菌落作为