通过原位杂交区分瞬时高危型hpv感染和持续高危型hpv感染的制作方法

通过原位杂交区分瞬时高危型hpv感染和持续高危型hpv感染的制作方法
【专利说明】通过原位杂交区分瞬时高危型HPV感染和持续高危型HPV 感染
[0001] 本申请要求2013年3月28日申请的美国临时申请序列号61/806, 360的优先权 的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文作为参考。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明总的来讲涉及原位杂交测定（insituhybridizationassays)和宫颈样 品分析，更准确地讲涉及用于测试人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV)感染的测定 及宫颈组织样品的分析。
[0004] 高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV)感染引起基本上所有宫颈癌和一部分头颈部 癌（ZurHausen,Virology384:260 - 265(2009))。然而，仅有HPV感染对于致癌性转化 是不够的；80-90 %的感染是瞬时的并且被免疫系统自我清除。目前的HPV检验方法如 HybridCapture?2(DigeneCorporation;Gaithersburg,MD)和GP5+/6+PCR虽然具有 极好的分析灵敏度但是无法将瞬时HPV感染与持续HPV感染区分开，而仅仅报告HPV阳性(Kroupis和Vourlidis,Clin.Chem.Lab.Med. 49:1783-1799(2011))。结果，这些检验对于 高级别上皮内瘤变（CIN2+)的临床特异性差（40-50%)，从而对许多妇女造成不必要的随 访程序（Kinney等人，Am.J.Clin.Pathol. 134:193 - 199(2010))。因此，对于既有分析灵敏 度又有临床特异性的HPV测定法有未满足的需求。
[0005] 因此，基于HPV核酸的存在来准确地评价宫颈组织样品并将其分类的方法存在需 求。本发明满足了这一需求并且也提供了相关优势。
[0006]发明概沐
[0007] 本发明涉及将宫颈组织或细胞学样品分类的方法，即通过使用反义E6或E7探针 在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测HPVDNA和HPV RNA;检测HPV核酸的存在；和基于HPV核酸表达将宫颈组织样品分类。
[0008] 附图简沐
[0009] 图1显示培养的Caski细胞的福尔马林固定石錯包埋錯块（formalin-fixed paraffin-embeddedblock)的系列切片。Caski细胞对于编码遍在蛋白（ubiquitin)的 UBC(内源RNA对照）（左栏）、针对HPV16E6/E7mRNA的反义探针（中栏）和针对HPV16E6/ E7DNA的有义探针（右栏）染色。上面一排，标准条件（无DNase)。下面一排，切片用DNase 预处理后与HPV探针杂交。RNAscope?染色信号呈棕褐色（DAB)。细胞核用苏木精染色 (蓝色）。
[0010] 图2显示在正常宫颈和不同组织学级别的HPV相关宫颈病变中的HPVE6/E7染色 图案（patterns)。使用针对18种亚型（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、 66、68、73和82)的一组探针，将宫颈活检样品对于高危型HPVE6/E7染色。正常宫颈对于 高危型HPV呈完全阴性。注意到CIN1在宫颈上皮层的上1/3中具有强染色，但是其染色图 案与CIN3的不相同，在整个上皮，信号似乎为细棕褐色颗粒。一些CIN2表现出如图所示的 中间图案。RNAsc〇pe_?染色信号呈棕褐色（DAB)。细胞核用苏木精染色（蓝色）。
[0011] 图3显示用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。 RNAscope⑩染色信号呈棕褐色（DAB)。细胞核用苏木精染色（蓝色）。
[0012] 图4显示用靶向高危型HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。上面 一排，20x透镜；下面一排，40X透镜。RNAscope?信号呈棕褐色（DAB)。细胞核用苏木精 染色（蓝色）。
[0013] 图5显示与图3中用RNase消化预处理后用靶向高危型HPV的反义探针或 相应有义探针染色的病变相同的CIN2病变。上面一排，20x透镜；下面一排40X透镜。 KNASCOpe?信号呈棕褐色（DAB)。细胞核用苏木精染色（蓝色）。
[0014] 图6显示与图3中用DNase预处理后用有义HPV探针染色的病变相同的CIN2病 变。左，20x透镜；右，40X透镜。RNAsc〇pe_3l信号呈棕褐色（DAB)。细胞核用苏木精染色 (蓝色）。
[0015] 图7显示宫颈上皮各层的示意图。
[0016] 发明详沐
[0017] 本发明涉及将宫颈组织样品的状态根据人乳头瘤病毒（HPV)分类的测定和方法。 高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV)感染引起基本上所有宫颈癌。本文公开的方法可以将宫颈 组织样品归类或分类为含有低级别病变或高级别病变的样品的可能性，低级别病变最有可 能被自我清除，高级别病变（被认为癌前期的）具有增加的进展到癌状态的可能性。本发 明的方法可以单独使用或者与已知的组织学筛查方法（例如来自Pap涂片）联合使用，以 将宫颈组织样品归类或分类。本发明的方法允许在给个体是否指示无治疗或是否应该实施 治疗方案中作出决定。本发明的方法基于将瞬时高危型HPV感染与持续高危型HPV感染区 分开，瞬时高危型HPV感染更有可能自发清除，持续高危型HPV感染具有增加的进展到癌状 态的可能性。
[0018] 如本文所用的，术语"核酸"或者术语"多核苷酸"是指核苷酸单体单元的多聚体， 正如本领域技术人员众所周知的。示例性的核酸包括例如DNA和RNA，包括mRNA、siRNA、 hnRNA、基因组DNA、cDNA或其它熟知的核酸形式。核酸或多核苷酸可以含有天然存在的核 苷酸，包括熟知的天然存在的核苷酸修饰，以及非天然存在的核苷酸（如通过化学合成制 备的核苷酸）。这样的修饰包括但不限于肽核酸（PNAs)，即修饰的寡核苷酸，例如，包含对 于生物学RNA或DNA不是典型的核苷酸的寡核苷酸，诸如2' -0-甲基化寡核苷酸等。多核苷 酸的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物，可以是天然或非天然的， 还可以是未取代的、未修饰的、取代的或修饰的。核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷 酸酯键合、甲基膦酸酯键合、硼烧磷酸酯键合（boranophosphatelinkages)等连接。多核 苷酸可以另外包含非核苷酸元件，诸如标记、猝灭剂（quenchers)、封闭基团等，正如本文所 公开的。多核苷酸可以是单链的或双链的。
[0019] 如本文所公开的，术语"HPV核酸"当在提及样品中使用时是指HPVDNA或RNA(特 别是mRNA)，或HPVDNA和HPVRNA(如HPVmRNA)的组合。
[0020] 如本文所用的，"核酸革巴（nucleicacidtarget) "或"革巴核酸（targetnucleic acid) "是指计划被检测的核酸或其区域。本领域技术人员能够容易地确定期望通过本发明 的方法检测的靶核酸。如本文所描述的，本发明涉及检测HPV核酸、特别是高危型HPV的方 法，如本文所公开的。因此，HPV核酸、特别是高危型HPV核酸是在本发明的方法中特别感 兴趣的靶核酸，如本文所公开的。
[0021] 如本文所用的，"标记（label)"是有利于检测分子的部分。在本发明正文中的普 通标记包括荧光标记、发光标记、光散射标记和/或比色标记。合适的标记包括酶及荧光 部分和显色部分，以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒等。在 本发明的一个特定的实施方式中，标记是酶。示例性的酶标记包括但不限于辣根过氧化物 酶（HRP)、碱性磷酸酶（ΑΡ)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，以及各种蛋白酶。其它标 记包括但不限于荧光团、二硝基苯（DNP)等。标记为本领域技术人员所熟知，如描述于例 如Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996)，和美国专 利号3, 817, 837、3, 850, 752、3, 939, 350、3, 996, 345、4, 277, 437、4, 275, 149和4, 366, 241。 许多标记是商业上可获得的并且可以用于本发明的方法和测定中，包括可检测酶/底物组 合（Pierce, Rockford IL ；Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX；Invitrogen, Carlsbad CA)。在本发明的一个特定的实施方式中，酶可以利用显色或发荧光底物以产生可检测信 号，如本文所描述的。本文中描述了示例性的标记。
[0022] 如本文所用的，"原位杂交（insituhybridization) "或"ISH"是指一种杂交 类型，其利用直接或间接标记的互补DNA或RNA链（如探针）与样品（特别是组织的一 部分或切片）中的特异性核酸（如DNA或RNA)结合并将其定位（原位）。探针类型可 以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使RNA(mRNA)、微小 RNA(microRNA)(miRNA)和/或合成寡核苷酸。术语"荧光原位杂交"或"FISH"是指利 用荧光标记的一种ISH类型。术语"显色原位杂交"或"CISH"是指具有显色标记的一种 ISH类型。ISH、FISH和CISH方法为本领域技术人员所熟知（参见例如，Stoler，Clinics inLaboratoryMedicine10 (1) :215-236 (1990)；Insituhybridization.A practicalapproach,Wilkinson编著,IRLPress,Oxford(1992)；Schwarzacher和 Heslop-Harrison,Practicalinsituhybridization,BIOSScientificPublishers Ltd,Oxford(2000))〇
[0023] 如本文所公开的，使用反义E6/E7探针，任选地在平行测定中辅助使用相应的有 义探针，能够同时检测来自HPV感染细胞的病毒DNA和RNA信号，使得可以将瞬时HPV感染 和持续HPV感染区分开。这种区别特征能够具有重要的临床应用，因为它能够允许通过HPV 感染的状态将宫颈病变分类成三个阶段-瞬时状态（transientstate) (CIN1样图案）、过 渡状态（transitionstate)(杂种图案）和持续状态（persistentstate) (CIN3样图案）-这和唯一的形态学标准相反。
[0024] 本发明的方法可以用于使用宫颈活检样品来评估疾病状态和进展的风险。CIN1和 CIN3信号图案和杂种图案代表与HPV感染相关的疾病进展的三个不同阶段。CIN1图案似 乎指示瞬时HPV感染，而CIN3图案似乎指示持续感染的建立。杂种图案似乎指示当病毒开 始在基底层中建立持续性时的过渡状态。因此，杂种和CIN3图案似乎指示高危型病变，而 CIN1图案指示低危型病变，该低危型病变很可能自我清除。
[0025] 通过HPVDNA/RNA染色图案将宫颈病变分类具有优于传统组织学CIN分级 别的优点。例如，CIN2的存在已被认为与真实疾病状态相反的诊断歧义（diagnostic ambiguity)(Galgano等人，Am.J.Surg.Pathol. 34:1077 - 1087 (2010))，因此导致治疗困 境（treatmentdilemma)或过度治疗。相比之下，本文公开的实验中观察到的杂种图案可 以为治疗决定做出提供更多的信息，因为它可指示病毒持续性的开始并因此应当像持续状 态一样进行治疗。HPVDNA/RNA染色图案也可以允许将一些CIN1病变再分类为高危型病 变，允许更早治疗和改善的结果，同时对具有真正低危型CIN1病变的患者不做积极随访 (aggressivefollowup)和/或治疗程序。同样，组织学上的CIN2和CIN3病变也可以通过 HPV感染的状态再归类并且根据病毒持续性的状态进行治疗。另外，HPVE6/E7RNA的不同水 平或HPVE6/E7mRNA和DNA的相对量可以与发生高级别CIN病变和宫颈浸润癌（invasive cervicalcancer)的不同风险水平相关（预后），再次允许更人性化管理。
[0026] 采用细胞学样品评估疾病状态和进展的风险也可以使用本发明的方法。与宫颈活 检样品的情形类似，通过反义或有义探针在细胞中强烈扩散染色的细胞核能指示瞬时感染 的细胞，而使用反义探针，细胞质染色的存在能指示持续感染的细胞，例如，通过病毒整合 到宿主基因组。再者，HPV感染的细胞的这两种类型及其绝对或相对细胞数和/或HPVE6/ E7mRNA和DNA的相对水平的识别可以用于指示低级别或高级别病变的存在或预测疾病进 展的风险（预后）。
[0027] 已知某些HPV亚型与增加的发生宫颈癌的可能性相关，而其它HPV亚型与发生宫 颈癌的低风险相关（参见例如，Burd,Clin.Microbio·Rev. 16:1-17(2003))。在被诊断患有 宫颈病变的患者中，确定一种或多种高危型HPV(HR-HPV)的E6/E7mRNA的存在可以用于确 定宫颈病变是良性的还是与CIN有关（参见W0 2012/103414 ;美国公布20120214152,所述 文献通过引用并入本文作为参考）。如本文所用的，18种亚型的以下HPV亚组被认为是高 危HPV亚型。这些高危HPV亚型包括但不限于HPV-16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、 56、58、59、66、68、73和82,并且该组在本文中也称为18种的HPV亚组。如有需要，十五种 册￥亚型包括册￥-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73的一个组在本文中也 称为15种的亚组，也可以用于宫颈病变的测试。在18种的HPV亚组中的各HPV亚型，或 者18种亚型中的一种或多种的组合，被认为是高危HPV亚型以在本文公开的方法中进行分 析。高危HPV亚型的另一个组可以是包括HPV-16和18的一组。高危HPV亚型的又一个组 可以是包括册￥-16、18、31、33、45、52和58的一组。应当理解，选自册￥-16、18、26、31、33、 35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82的高危册￥亚型中的任何一种或多种可以用 作核酸靶以检测高危型HPV，例如，在本发明的方法中作为针对HPV高危HPV亚型中的任何 一种或多种的E6和/或E7区域的探针。因此，在本发明的一个实施方式中，探针包含靶探 针组，其与选自 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和 82 的HPV亚 型中的一种或多种（包括多达所有的HPV亚型）的E6和/或E7区域互补。在另一个实施 方式中，探针包含探针组，其与HPV亚型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73 中的一种或多种（包括多达所有的HPV亚型）的E6和/或E7区域互补。在又一个实施方 式中，探针包含探针组，其与HPV亚型16、18、31、33、45、52和58中的一种或多种（包括多 达所有的HPV亚型）的E6和/或E7区域互补。在另一个实施方式中，探针包含探针组，其 与HPV亚型16和/或18的E6和/或E7区域互补。
[0028] 众多HPV亚型的序列是本领域已知的并且可以容易地由本领域技术人员鉴定。 HPV亚型序列的示例性来源可以例如在国家生物技术信息中心（theNationalCenter forBiotechnologyInformation,NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov)上找到。不例性的HPV 亚型序列可以例如在NCBIGenBank数据库中找到并且包括但不限于以下的代表性基 因组序列：HPV-16(NC_001526. 2;GI:310698439) ;HPV-18(AY262282.1;GI:30172004)， HPV-26(NC_001583. 1 ；GI:9627305),HPV-31(J04353. 1 ；GI:333048),HPV-33(M12732. 1 ； GI:333049),HPV-35(M74117. 1 ；GI:333050),HPV-39(KC470248. 1 ；GI:537802154), HPV-45 (KC470260. 1 ;GI:537802294)，HPV-51 (M62877. 1 ;GI:333087;Lungu等人，了· Virol.65:4216 - 4225(1991))，HPV-52(37751. 1 ;GI:337238732)，HPV-53(NC_001593. 1 ; GI:9627377),HPV-56 (EF177181.1 ；GI:138374823),HPV-58 (D90400. 1 ；GI:222386), HPV-59(X77858. 1 ；GI:557236),HPV-66(U31794. 1 ；GI:1020290),HPV-68(KC470283. 1 ； GI:537802536)，HPV-73(X94165. 1 ;GI:1491692)和HPV-82(AB027021. 1 ;GI:6970427)。各 种高危HPV亚型的其它代表性序列在NCBIGenBank数据库也可获得。
[0029] 在NCIBGenBank数据库可获得的此类基因组序列包括例如指明E6基因和E7 基因的位置的注释。因此，本领域技术人员能够使用本领域技术人员熟知的常规方法容 易地确定和鉴别合适的序列以用作E6和E7编码区的有义或反义探针（也参见Burd等 人，参见上文，2003,关于HPV基因组组构和编码基因的描述）。这样的适当区域的选 择和与靶核酸、特别是与靶核酸特异性和选择性结合的寡核苷酸或探针结合的特异性和 选择性试剂的设计都是本领域技术人员众所周知的（参见Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratory,New York(2001);Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyand Sons,Baltimore,MD(1999)。使用适当选择革El核酸的区域以及结合剂（如寡核苷酸或探针） 的适当长度可以实现期望的特异性，并且这样的选择方法为本领域技术人员所熟知。因此， 本领域技术人员将容易地理解并且能够容易地确定适当的试剂，如寡核苷酸或探针，其可 以用于靶向一种特定靶核酸优于另一种靶核酸。
[0030] 在本发明的一个实施方式中，用原位杂交（ISH)测定来检测来源于女性个体子宫 颈的组织切片或细胞学样品中的一种或多种高危HPV亚型的E6和/或E7mRNA和/或DNA 的存在。组织样品得自个体，例如，使用检查程序（如阴道镜检查）；或者可以得自宫颈组织 活检。细胞学样品可以使用常规检查程序如Pap涂片或类似技术从子宫颈获取。任选地，样 品可以使用众所周知的组织学方法先前已经分类和/或先前已经鉴别为HPV阳性。可以将 样品在福尔马林固定的、石蜡包埋的（FFPE)切片中捕获，施用到固体表面（如载玻片）或 在溶液中（如在细胞学涂片中）悬浮，并且任选地施用到固体支持物（如载玻片）上。当 使用FFPE组织切片时，组织可任选地用组织预处理剂处理，如在柠檬酸盐缓冲液中加热， 然后用蛋白酶消化，或者用其它熟知的方法加工FFPE用于ISH测定。在一个特定的实施方 式中，组织或细胞学样品例如用加热和/或缓冲剂预处理，以促进与DNA杂交。准备好样品 后，进行ISH测定以检测样品中的高危HPV亚型。
[0031] 在本发明的方法中使用的ISHHPV测定中，一般而言，设计多个靶探针组以在高危 HPV亚型的E6和/或E7mRNA或DNA的区域里面与多种靶核酸杂交。应当理解，在使用本发 明的方法评价宫颈样品中HPV核酸的存在时使用术语"靶探针"可以指单一探针或可以包 括针对一种或多种高危HPV亚型的多个靶探针组。在一个特定的实施方式中，多种靶核酸 可以包括18种的HPV亚组。在另一个实施方式中，多种靶核酸可以包括15种的HPV亚组。 在又一个实施方式中，靶核酸可以是仅HPV-16。把各靶探针组设计为识别一种HPV亚型，并 且靶探针组可以单独地使用或在一个池子（pool)中使用，这取决于HPV亚型是打算单独地 检测还是作为一个组一起（无差别地）检测。在一个特定的实施方式中，各靶探针组可以 含有适合于通过检测该组中所有靶探针的通用信号放大系统检测的完全相同的识别序列， 如本文所描述的。如本文所用的这样一种通用放大系统一般是放大系统，其中使用同一标 记来检测靶探针组中的所有高危HPV亚型。
[0032] 在传统上，宫颈组织样本，举例来说，如在Pap涂片或宫颈组织活检中，分别基于 细胞学或组织学进行分级别。宫颈组织样本由将样本根据其形态学分级别的临床医师来观 察。宫颈组织样本的这种组织学分级别方法为本领域所熟知（参见例如，CecilTextbook ofMedicine，Bennett和Plum编著，第 20 版，WBSaunders，Philadelphia(1996); ColposcopyandTreatmentofCervicalIntraepithelialNeop1asia:A Begirme?sManual(宫颈上皮内瘤变的阴道镜检查和治疗：初学者手册），SellOTs 和Sankaranarayanan编著，Internationa1AgencyforResearchon Cancer，Lyon，France(2003);Kalaf和Cooper，J.Clin.Pathol. 60:449-455(2007);Brown 和Trimble，BestPract.Res