获标记至感兴趣核酸。
[0136] 在一个实施方式中，m个标记扩展子全都具有L-2的L-1 5'或全都具有L-2的L-1 3'。在一个实施方式中，标记探针系统包含放大多聚体或辅放大子，所述放大多聚体或辅放 大子能够与m个标记扩展子的至少两个杂交。在一个实施方式中，标记探针系统包含辅放 大子、放大多聚体和标记探针；其中辅放大子能够同时与m个标记扩展子中的至少两个和 与多个放大多聚体杂交；其中放大多聚体能够同时与辅放大子和与多个标记探针杂交；和 其中标记探针包含标记。在一个实施方式中，标记探针系统包含放大多聚体和标记探针；其 中放大多聚体能够同时与m个标记扩展子中的至少两个和与多个标记探针杂交；和其中标 记探针包含标记。在一个实施方式中，标记探针系统包含标记探针；其中标记探针能够同 时与m个标记扩展子中的至少两个杂交；和其中标记探针包含标记。在一个实施方式中， 标记探针系统的组分能够同时与m个标记扩展子的两个杂交。在一个实施方式中，杂交温 度为比在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的Tm高约5°C或5°C 以上。在一个实施方式中，杂交温度为比在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分 之间的复合物的Tm高约7°C或7°C以上、约10°C或10°C以上、约12°C或12°C以上、约15°C 或15°C以上、约17°C或17°C以上或约20°C或20°C以上。在一个实施方式中，多核苷酸序列 L-2为长度20个核苷酸或少于20个核苷酸。在一个实施方式中，L-2为长度在9个和17 个核苷酸之间。在一个实施方式中，L-2为长度在13个和15个核苷酸之间。在一个实施 方式中，至少两个标记扩展子中的每一个都具有在其5'末端的L-1和在其3'末端的L-2。 在一个实施方式中，至少两个标记扩展子中的每一个都具有在其3'末端的L-1和在其5' 末端的L-2。
[0137] 一个进一步实施方式可以包括检测一种或多种感兴趣核酸的方法，即通过a)提 供包含一种或多种感兴趣核酸的样品；b)使用本文公开的方法标记感兴趣核酸；c)提供包 含标记的标记探针系统；d)对于感兴趣核酸中的每一种，提供m个标记扩展子的子集，其中 m为至少两个，其中m个标记扩展子的子集能够与该感兴趣核酸杂交，其中标记探针系统的 组分能够同时与子集中的m个标记扩展子的至少两个杂交，其中至少两个标记扩展子中的 每一个都包含与感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-1并且包含与标记 探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列L-2,和其中至少两个标记扩展子 全都具有L-2的L-1 5'或全都具有L-2的L-1 3' ；e)使每一种感兴趣核酸与m个标记扩展 子的其相应子集杂交；f)使标记探针系统与标记扩展子在杂交温度下杂交，所述杂交温度 大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的解链温度Tm，凭此， 对于感兴趣核酸中的每一种，至少两个标记扩展子中的每一个的单拷贝同时与感兴趣核酸 的单拷贝和与标记探针系统的组分的单拷贝杂交；和g)检测靶核酸上的标记的存在与否。
[0138] 在再一个实施方式中，方法可以包括捕获标记至感兴趣核酸，即通过a)提供m个 标记扩展子，其中m为至少两个，其中m个标记扩展子能够与感兴趣核酸杂交；b)提供包 含标记的标记探针系统，其中标记探针系统的组分能够同时与m个标记扩展子的至少两个 杂交，其中至少两个标记扩展子中的每一个包含与感兴趣核酸中的多核苷酸序列互补的多 核苷酸序列L-1并且包含与标记探针系统的组分中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列 L-2,和其中至少两个标记扩展子全都具有L-2的L-1 5'或全都具有L-2的L-1 3' ；c)使 感兴趣核酸与m个标记扩展子杂交；和d)使标记探针系统与m个标记扩展子在杂交温度下 杂交，所述杂交温度大于在每一个个体标记扩展子和标记探针系统的组分之间的复合物的 解链温度Tm，凭此至少两个标记扩展子中的每一个的单拷贝同时与感兴趣核酸的单拷贝和 与标记探针系统的组分的单拷贝杂交，从而捕获标记至感兴趣核酸。
[0139] 应当理解，在本文提供的本发明的定义中也提供了不实质上影响本发明的各种实 施方式的活性的修改。因此，以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
[0140] 实施例I
[0141]Caski细胞中的HPV检测
[0142] 本实施例描述了Caski细胞中HPV核酸的检测。
[0143]基于R"NAsc〇pe?技术（AdvancedCellDiagnostics)开发RNA原位杂 交（ISH)测定以检测HR-HPV的E6和E7致癌基因的mRNA(Bishop等人，Am.J.Surg.Pathol. 36:1874-1882(2012);Schache等人，Br.J.Cancerl08:1332-1339 (2013); Ukpo等人，Am.J.Surg.Pathol. 35:1343-1350 (201 1);Wang等人，了.]\1〇1· Diagn. 14:22 - 29 (2012))。在该测定中，观察到常见的核染色核染色，这可能是源于HPV感 染的细胞中的DNA。为了调查这件事情，使用靶向E6和E7基因的探针，在已知携带HPV16 的宫颈癌细胞系Caski上进行了RNAscope?ISH测定。使用两种类型的探针：与E6和 E7mRNA互补的标准反义探针和靶向相同区域但在与E6/E7mRNA相同意义中的有义探针（探 针组在商业上可获自AdvancedCellDiagnostics)。换句话说，反义探针能与E6和E7mRNA 和具有与mRNA相同的意义的DNA链杂交。因此，将有义探针设计为仅仅检测HPVDNA，而反 义探针能既检测mRNA又检测DNA。此外，来自有义探针的信号应该是DNase敏感的，而来自 反义探针的信号应该是部分敏感的：DNA信号应该由于DNase处理被消灭/削弱，但是mRNA 来源的信号应该保留下来。这些预期结果在Caski细胞中观察到（图1)。
[0144] 图1显示培养的Caski细胞的福尔马林固定石蜡包埋蜡块的系列切片。Caski细胞 对于编码遍在蛋白的UBC(内源RNA对照）（左栏）、针对HPV16E6/E7mRNA的反义探针（中 栏）和针对HPV16E6/E7DNA的有义探针（右栏）染色。上面一排显示标准条件（无DNase)。 在下面一排，切片用DNase预处理后与HPV探针杂交。RNAscope?:染色信号呈棕褐色 (DAB)，细胞核用苏木精染色（蓝色）。
[0145] 因此，本实验证明靶向HPVE6/E7mRNA测定的标准反义探针确实能够同时检测HPV DNA和mRNA。本实验也证明应用有义探针作为用于区别DNA-和RNA-来源的信号的方法的 能力。
[0146] 这些结果证明检测HPV核酸的探针可以用于同时检测细胞中的HPVDNA和mRNA。
[0147] 实施例II
[0148] 宫颈组织样品中的HPV检测
[0149] 本实施例描述了宫颈组织样品中HPV核酸的检测。
[0150] 已知高危型HPVE6/E7mRNA在高级别CIN病变（CIN2+)中被上调但在低级别病 变（0預1)中没有上调（1^6和1(1^8七611861131。61^1^￥.]\1〇1.0丨&811.8:405 - 415(2008))。 基本上如实施例I中所描述的方法在宫颈组织样品上进行原位杂交测定。简而言之，通 过100%二甲苯和乙醇洗涤将5微米厚度载玻片固定的切片脱石蜡。然后，组织用市售的 缓冲液（AdvancedCellDiagnostics)进行系列处理：预处理1溶液（内源氢过氧化物 酶用预处理1溶液在室温下封闭10分钟）；预处理2 (100°C，在预处理2溶液中浸没15 分钟）；和预处理3(蛋白酶消化，40°C达30分钟）；在每一个预处理步骤之后进行用水漂 洗。然后，组织在HR18HPV杂交溶液中（无需盖玻片）在HybEZOven(AdvancedCell Diagnostics,Hayward,CA)中于40°C杂交2小时。在洗涤缓冲液步骤之后，通过以下的 系列应用进行杂交后的探针的信号放大：Amp1(辅放大子步骤）、Amp2(信号增强子步 骤）、Amp3 (放大子步骤）、Amp4 (标记探针步骤）、Amp5和Amp6 (信号放大步骤）；在 每一个Amp步骤之后进行洗涤缓冲液步骤。然后，HRP活性通过在环境温度下将3, 3' -二 氨基联苯胺（DAB)应用10分钟来证明。然后，切片用苏木精复染色，通过分等级的乙醇 (50%、70%和 100%)和二甲苯脱水，然后用CytosealXYL(ThermoFisherScientific Inc.，Waltham,MA)封固。
[0151] 图2显示正常宫颈和不同组织学级别的HPV相关宫颈病变中的HPVE6/E7染色 图案。使用针对 18 种亚型（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和 82)的一组探针，将宫颈活检样品对于高危型HPVE6/E7染色。正常宫颈对于高危型HPV呈 完全阴性。注意到CIN1在宫颈上皮层的上1/3中具有强染色，但是其染色图案与CIN3的 不相同，在整个上皮，信号似乎为细棕褐色颗粒。一些CIN2表现出如图所示的中间图案。 染色信号呈棕褐色（DAB)，并且细胞核用苏木精染色（蓝色）。
[0152] 出乎意料的是，所检测的RNAscope?HPVE6/E7mRNA测定在CIN1和CIN2+病变 中测得了强烈的信号（图2)。然而，CINUCIN2和CIN3病变中的信号图案明显不同。在CIN1中，在许多细胞中但仅在上皮的浅表层中存在扩散完全核染色，而在CIN3中，主要在 累及多数上皮的细胞质中，染色似乎为细颗粒。在一些CIN2病变中，观察到杂种信号图案； 在靠下方的上皮中，在浅表层和细胞质信号中有强烈完全核染色。在CIN1中，出乎意料的 强染色预期是来自HPVDNA，这与在Caski细胞中观察的类似（图1)。扩散核信号可能代 表在病毒生活周期的繁殖期中产生的病毒DNA，这在HPV基因组扩增之后，但在病毒衣壳从 宿主细胞释放之前。因此，CIN1E6/E7染色图案似乎代表瞬时HPV感染，而CIN3E6/E7图案 似乎代表持续HPV感染。
[0153] 为了确定信号的性质，使用有义探针和DNase/RNase处理来确认CIN1和CIN2病 变中的扩散核信号是来自与HPVDNA杂交的反义探针。在图3中，CIN2病变的系列切片用 针对HR-HPV的有义或反义E6/E7探针染色。图3显示用靶向高危型HPV的反义探针或相 应有义探针染色的CIN2病变。RNAscope?染色信号呈棕褐色（DAB)，并且细胞核用苏木 精染色（蓝色）。
[0154] 常规反义探针检测到"杂种"信号图案，其中在浅表层中均具有强烈扩散核染色 (图3,指向左边的箭头）和在细胞质和细胞核中均具有细颗粒染色（图3,指向右边的箭 头）。然而，有义探针仅检测到上皮靠上方部位中的强烈核染色，这似乎与用反义探针在病 变的相同区域中见到的惊人相似。这些数据提供了用反义探针见到的CIN1和CIN2病变中 的扩散核染色可能来自HPVDNA的初步支持，也借助其通过有义探针的检测。
[0155] 在一个独立的实验中，用DNase和RNase来进一步确认CIN2病变中所观察到的信 号的DNA或RNA性质。图4显示用反义和有义探针的染色结果。图4显示用靶向高危型 HPV的反义探针或相应有义探针染色的CIN2病变。顶上图是20x透镜；靠下方的图是40X 透镜。RNAscope?信号呈棕褐色（DAB)，并且细胞核用苏木精染色（蓝色）。
[0156] 在上皮的顶上浅表层中用两种探针观察到强烈扩散核染色（图4,指向左边的箭 头）。反义探针也检测到基底层中的另外的细胞质染色，这可以在更高放大倍数（40X)下更 清晰地见到（图4,指向右边的箭头）。
[0157] 图5显示与图3中用RNase预处理，然后用靶向高危型HPV的反义探针或相应有 义探针染色相同的cm2病变。顶上图是2〇x透镜；靠下方的图是4〇x透镜。RNAseopef)， 信号呈棕褐色（DAB)，并且细胞核用苏木精染色（蓝色）。用反义或有义探针，在上层中，用 RNase预处理对强烈完全核染色无影响，但是使用反义探针，在基底层中，所观察到的较弱 的细颗粒细胞质信号的确被消灭，因此证实了后者信号的RNA性质（图5)。
[0158] 图6显示与图3中用DNase预处理，然后用有义HPV探针染色相同的CIN2病变。 左图是20x透镜；右图是40X透镜。RNAscope⑧信号呈棕褐色（DAB)，并且细胞核用苏木 精染色（蓝色）。用DNase预处理引起在上层中用有义探针所观察到的扩散染色细胞的数 目显著减少（图6)。剩余的信号多半是由于不完全DNase消化。DNase处理实验与有义探 针的应用合在一起证实了该病变上层中的强烈完全核信号是来自HPVDNA。
[0159] 在imAsc.Qpe? ISH测定中通过有义探针所检测的信号图案与先前使用 常规DNA原位杂交技术报道的信号图案相类似（DeMarchiTriglia等人，Gynecol.Oncol. 112(1)，114 - 118(2009);Evans等人，Mod.Pathol. 15:1339 - 1347(2002))。然而， 用相同探针同时检测HPVDNA和RNA二者尚未见报道。
[0160] 这些结果证明HPV核酸（DNA和mRNA二者）的检测可以在同一测定中同时被检测 并且可以用于将宫颈组织样品分层和分类。
[0161] 在本申请中，引用了多种不同的出版物。这些出版物的公开内容以其整体通过引 用并入本申请中作为参考以便更全面地描述本发明所属领域的现有状态。虽然本发明已经 参照以上提供的实施例进行了描述，但是应当理解，在不偏离本发明的精神的情况下，可以 作出各种修改。
【主权项】
1. 将宫颈组织样品分类的方法，包括： (a) 使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探 针能同时检测高危型HPV DNA和HPV RNA ; (b) 检测HPV核酸的存在；和 (c) 将该宫颈组织样品分类， 其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时状态， 其中在宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒 染色的存在指示持续状态，或 其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品的上皮的中 间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡状态。2. 权利要求1的方法，其中所述瞬时状态相当于瞬时HPV感染状态。3. 权利要求1的方法，其中所述持续状态相当于持续HPV感染状态。4. 权利要求1的方法，其中所述过渡状态相当于过渡HPV感染状态，其具有增加的过渡 到持续HPV感染状态的可能性。5. 权利要求1的方法，其中仅在宫颈组织样品的上皮的浅表层中HPV DNA的检测指示 低级别病变。6. 权利要求1的方法，其中在宫颈组织样品的上皮的中间层和基底层中HPV RNA的检 测指示高级别病变。7. 权利要求1的方法，其中在宫颈组织样品的上皮的基底层或中间层中HPV RNA和在 宫颈组织样品的上皮的浅表层中HPV DNA的检测指示高级别病变。8. 权利要求1的方法，其中HPV RNA的检测指示高级别病变。9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPV DNA和HPV RNA010. 权利要求1-9中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选自 HPV 亚型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和 82 中的一种或多种。11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前使 双链DNA变性。12. 将宫颈细胞学样品分类的方法，包括： (a) 使用反义E6或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7 探针能同时检测高危型HPV DNA和HPV RNA ; (b) 检测HPV核酸的存在；和 (c) 将该宫颈细胞学样品分类， 其中仅在宫颈细胞学样品的细胞中HPV核酸的扩散核染色的存在指示该细胞中的瞬 时HPV感染状态，或 其中在宫颈细胞学样品的细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在 指示该细胞中的持续HPV感染状态。13. 权利要求12的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中HPV核酸的仅扩散 核染色的存在指示该样品相当于瞬时HPV感染状态。14. 权利要求12的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中在细胞质和/或细 胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该样品相当于持续HPV感染状态。15.权利要求12的方法，其中在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的HPV 阳性细胞和具有HPV核酸的扩散核染色的细胞的混合物的存在指示过渡到持续HPV感染状 态的可能性。16.权利要求12-15中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPV DNA和 HPV RNA017.权利要求12-16中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选 自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多 种。18.权利要求12-17中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前 使双链DNA变性。19.基于宫颈组织样品的分析确定患者结果的预后的方法，包括： (a)使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探 针能同时检测高危型HPV DNA和HPV RNA ; (b)检测HPV核酸的存在；和 (c)将该宫颈组织样品分类， 其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时HPV感染 状态， 其中在宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒 染色的存在指示持续HPV感染状态，或 其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品的上皮的中 间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡HPV感染状态。20.权利要求19的方法，其中瞬时HPV感染状态的确定指示增加的清除HPV感染的可 能性。21. 权利要求19的方法，其中持续感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能 性。22.权利要求19的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到持续HPV感 染状态的可能性。23.权利要求22的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可 能性。24.权利要求19-23中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPV DNA和 HPV RNA025.权利要求19-24中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选 自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多 种。26.权利要求19-25中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前 使双链DNA变性。27.基于宫颈细胞学样品的分析确定患者结果的预后的方法，包括： (a)使用反义E6或E7探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7 探针能同时检测高危型HPV DNA和HPV RNA ; (b)检测HPV核酸的存在；和 (c) 将该宫颈细胞学样品分类， 其中仅在宫颈细胞学样品的细胞中HPV核酸的扩散核染色的存在指示该细胞中的瞬 时HPV感染状态，或 其中在宫颈细胞学样品的细胞中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在 指示该细胞中的持续HPV感染状态。28.权利要求27的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中HPV核酸的仅扩散 核染色的存在指示该样品相当于瞬时HPV感染状态。29.权利要求27的方法，其中在宫颈细胞学样品的HPV阳性细胞中在细胞质和/或细 胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示该样品相当于持续HPV感染状态。30.权利要求27的方法，其中在细胞质和/或细胞核中具有HPV核酸的颗粒染色的HPV 阳性细胞和具有HPV核酸的扩散核染色的细胞的混合物的存在指示过渡到持续HPV感染状 态的可能性。31.权利要求27的方法，其中瞬时HPV感染状态的确定指示增加的清除HPV感染的可 能性。32.权利要求27的方法，其中持续感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可能 性。33.权利要求27的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到持续HPV感 染状态的可能性。34.权利要求33的方法，其中过渡HPV感染状态的确定指示增加的进展到癌状态的可 能性。35.权利要求27-34中任一项的方法，其中检测HPV核酸的存在包括检测HPV DNA和 HPV RNA036.权利要求27-35中任一项的方法，其中反义E6或E7探针能检测高危型HPV，其选 自HPV亚型16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82中的一种或多 种。37.权利要求27-36中任一项的方法，其中将样品预处理以在进行原位杂交测定之前 使双链DNA变性。
【专利摘要】本发明涉及将宫颈组织或细胞学样品分类的方法，即通过使用反义E6或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6或E7探针能同时检测HPV？DNA和HPV？RNA；检测HPV核酸的存在；和基于HPV核酸表达将宫颈组织样品分类。
【IPC分类】C12Q1/70, G01N33/53
【公开号】CN105247077
【申请号】CN201480031040
【发明人】马小骏, 王宏伟, 吴兴永, 罗宇龄
【申请人】领先细胞医疗诊断有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年3月28日
【公告号】EP2978863A1, US20140357509, WO2014160949A1