.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242 (2012);Waxman等 人，Obstet.Gynecol. 120:1465-1471 (2012))。显示在宫颈样品分级别中使用的各种术语的 表格;^于表1。
[0033] 表1.宫颈细胞分级别目录（Sellors和Sankaranarayanan，同上，2003)
[0034]
[0035] CIN:宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasia);LSIL:低级别鱗 状上皮内病变（Low-gradesquamousintraepitheliallesion) ;HSIL:高级别鳞状上皮内 病变（High-grade squamous intraepithelial lesion) ;ASCUS :不能明确意义的不典型鱗 状细胞（Atypical squamous cells of undetermined significance) ;AGUS :不能明确意 义的不典型颗粒状细胞（Atypical glandular cells of undetermined significance)〇
[0036] 在历史上，已用三级别系统CIN1、CIN2和CIN3和两级别系统LSIL和HSIL来将宫 颈组织样品基于除正常组织以外的细胞或组织的组织学进行分类（参见表1)。当用CIN级 别或其它组织学标准来将宫颈组织样品分级别时，诊断的可靠性可能是有问题的，因为CIN 的组织学诊断依赖于细胞发现和形态学的主观解释。诊断准确性和再现性差可能很复杂并 且造成患者忧虑。CIN级别在活检上的不正确分类能导致患者的不适当随访或治疗。临床 医师冒着过度治疗良性病变或错误处理癌前期病变的风险。本发明提供基于HPV高危亚型 核酸的存在和HPV感染状态的确定，辅助评估和诊断宫颈组织样本的方法。
[0037] 目前，Pap (Papanicolaou)涂片或在宫颈癌筛查期间获得的液基细胞学材料（例 如，ThinPrep ;Hologic ;Bedford MA)受到与基于组织学的宫颈活检处理相同的限制。基于 细胞学，宫颈细胞的形态学一般不能用于得出是否该原因可能与HPV感染有关的结论。另 外，良性HPV感染所致的形态学变化不能将恶性和癌前期HPV病变区分开。本文公开的方 法的一个优点是它可以测试在分子水平上宫颈病变的性质，并因此确定是否宫颈病变很可 能与瞬时、持续或过渡HPV感染有关，如本文所公开的。
[0038] 本文公开的本发明的方法可以用于确定宫颈组织样品（包括诊断患有宫颈病变 的患者）中的一种或多种高危HPV亚型的E6和/或E7mRNA和/或DNA的表达，和任选地， E6和/或E7mRNA和/或DNA的水平的空间图案，以评价HPV感染的状态和朝完全恶性肿 瘤的潜在进展，从而帮助此类患者的处理和随访治疗。目前，尚没有良好的方法来帮助处理 患有低级别宫颈病变的患者，尽管这样的病变可能会进展或退变。目前可获得的方法一般 测试基于组织学分级别朝恶变进展或退变的可能性，组织学分级别将上皮内宫颈瘤样病变 分类为CIN1、CIN2、CIN3 和浸润癌（Schiffman等人，Lancet370:890-907(2007))。CIN2 或更坏（CIN2+)的分类被认为是介入性外科手术的阈值。然而，仅根据组织学的CIN2诊断 是高度易变的并且不准确，从而导致不是治疗不足就是过度治疗（Stoler和Schiffman，J. Am.Med.Assoc. 285:1500-1505(2001))。对从那些将具有退变的妇女中预测哪些妇女将会 进展到较高级别病变无能为力导致给所有妇女相同的高强度随访和测试，这浪费了财政和 医疗资源，同时也降低了患者的工作生产力。
[0039] 本文公开的本发明的基于HPVE6/E7核酸的方法能更好地定义宫颈病变的 HPV感染状态和致癌活性，并且更好地反映出疾病进展或退变（Ho等人，Int.J.Cancer 127, 622-632 (2010))。因此，本发明的一个实施方式是使用ISH测定来检测高危HPV亚型 的E6和/或E7mRNA和/或DNA的空间图案和水平。这样的亚型的一个组是18种的HPV 亚组，如本文所公开的。这样的亚型的另一个组是15种的HPV亚组，如本文所公开的。仅 HPV-16也可用作高危HPV亚型。通过确定患者的宫颈样品（包括含有预先确定的病变（如 CIN级别）的样品）的HPV感染状态，本发明提供基于在宫颈组织样品或病变中任何HPV 感染状态的性质，对患者更有见识拣别分类的基础。这为临床医师提供了关于疾病进展风 险的更多信息，并且鉴于可能的多次办公室访视和/或重复的细胞学和阴道镜检查，可以 用于更有效地处理个体患者。通过更好地评价疾病进展的阶段和病毒持续性和潜在癌症发 生的风险，本文公开的提供ISHHPV核酸测定的方法能够因此提供最佳疾病处理的客观信 息。例如，基于疾病进展的阶段和癌症发生的风险的评估，人们可以选择对患者最佳的治疗 选项。人们还可以最优化用于患者的重复试验的频率。
[0040] 如本文所公开的，本发明涉及使用原位杂交（ISH)测定，基于高危HPV亚型的灵敏 检测将宫颈组织样品分类、归类和/或分层的方法（参见实施例I和II)。该测定基于同时 检测相同样品中的HPVDNA和mRNA的能力，从而提供关于宫颈组织样品的HPV感染状态的 信息。如本文所公开的，关于HPV感染状态的信息可以用于补充宫颈样品的组织学分析以 提供比组织学分析或先前仅HPV测试更有效的诊断。本发明的方法可以用于将宫颈组织样 品分类，以确认宫颈组织样品的组织学分析，或将先前已通过组织学和/或HPV的存在分类 的宫颈组织样品再分类。
[0041] 在一个实施方式中，本发明提供将宫颈组织样品分类的方法。该方法可以包括使 用反义E6和/或E7探针在宫颈组织样品上进行原位杂交测定，其中反义E6和/或E7探 针能同时检测高危型HPVDNA和HPVRNA;检测HPV核酸的存在；和将宫颈组织样品分类， 其中仅在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时状态，其中在 宫颈样品的上皮的中间层和基底层中在细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在 指示持续状态，或其中在宫颈样品的上皮的浅表层中HPV核酸的扩散核染色和在宫颈样品 的上皮的中间层的细胞质和/或细胞核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡状态。
[0042] 本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类。如本文所公开的，预期在宫颈样品 的高级别CIN病变（CIN2+)中，高危HPV亚型将表现出E6/E7mRNA表达的上调。出人意外 地发现在先前分类为CIN1的低级别宫颈病变中检测到HPV核酸（参见实施例II)。在宫颈 病变的所有三个种类一CINUCIN2和CIN3中检测到HPV核酸。然而，CIN病变的每一个种 类中HPV核酸的检测图案对于每一个种类是有区别的（参见实施例II)。进一步揭示，针对 高危HPV亚型的E6和/或E7区域的反义探针能够同时检测HPVDNA和HPVmRNA，而HPV DNA和mRNA的同时检测使得可以基于宫颈样品的细胞的HPV感染状态将宫颈组织样品进一 步分类。
[0043] 具体地说且如本文所公开的，已确定先前分类为CIN1的宫颈组织样品表现出HPV 核酸的扩散核染色，但是仅在宫颈样品的上皮的浅表层中。已证明CIN1样品中存在的HPV 核酸是HPVDNA。先前分类为CIN3的宫颈组织样品也表现出截然不同的HPV核酸染色图 案。在CIN3病变中，宫颈样品表现出在整个上皮，最明显的是在宫颈上皮的中间层和基底 层中，在细胞质和细胞核中的HPV核酸的颗粒染色。先前分类为CIN2的宫颈组织样品还具 有另一种染色图案，这似乎是介于CIN1和CIN3宫颈病变图案之间的杂种图案。特别是在 CIN2病变中，宫颈样品表现出在宫颈上皮的浅表层中的HPV核酸的扩散核染色以及宫颈上 皮的中间层的细胞的细胞质和细胞核中的HPV核酸的颗粒染色。HPV核酸的扩散核染色具 有与CIN1病变类似的外观，而细胞质和细胞核中的HPV核酸的颗粒染色具有与CIN3病变 类似的外观。因此，宫颈组织样品中的HPV核酸染色图案可以用于将宫颈样品分类为低级 别的CIN1样病变或分类为高级别的CIN2样或CIN3样病变。如本文所描述的和本领域已 知的，CIN2病变一般被分类为高级别病变。
[0044] 进一步如本文所公开的，扩散核染色vs颗粒细胞质和核染色的截然不同的HPV核 酸染色图案经测定与DNAvsmRNA表达相关。具体地说，发现用HPV反义探针观察到的扩 散核染色图案也用HPV有义探针观察到（参见实施例II)。如本文所公开的，有义探针能 与DNA杂交但不与mRNA杂交。这一观察结果使用RNase和DNase得到证实，RNase不降低 扩散核染色的信号，而DNase降低该信号。因此，可以确定在CIN1和CIN2病变中观察到的 HPV核酸的扩散核染色相当于HPVDNA。
[0045] 仅在CIN1病变的浅表层中的相当于HPVDNA的扩散核染色的观察结果很可能是 在病毒生活周期的繁殖期中产生的病毒DNA，这在HPV基因组扩增之后，但在病毒衣壳从宿 主细胞释放之前。虽然该测定将每个拷贝的靶核酸染色成信号〃斑点（dot)"，因为HPV基 因组扩增典型地产生非常大量的HPVDNA拷贝，所以每个拷贝的斑点染色（dottedstain) 彼此重叠产生扩散染色图案。已知CIN1病变频繁地自发清除HPV感染。因此，CIN1病变 的HPV感染状态是瞬时的。本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类相当于瞬时HPV感 染状态的瞬时状态。
[0046] 另外如本文所公开的，发现细胞核和细胞质中的颗粒染色相当于HPVmRNA。这是 基于颗粒状细胞核和细胞质染色图案用反义探针见到但用有义探针见不到的观察结果。这 一观察结果用RNase处理得到确认，RNase处理显著减少颗粒染色（参见实施例II)。在 CIN3病变中在整个上皮层（最明显在中间层和/或基底层中）的细胞的细胞质和/或细 胞核中的颗粒状HPV核酸染色的观察结果与在活跃E6和/或E7mRNA表达中反映出的持续 HPV感染的建立相关。HPVmRNA的颗粒状细胞质和细胞核染色很可能反映出在CIN3病变 中持续HPV感染的建立。因此，CIN3病变的HPV感染状态是持续的。本发明的方法可以用 于将宫颈组织样品分类为相当于持续HPV感染状态的持续状态。
[0047] 进一步如本文所公开的，在CIN2病变中观察到杂种HPV核酸染色图案。如本文所 描述的，CIN2中的扩散核染色，类似于在CIN1中观察到的染色图案，经测定是HPVDNA(参 见实施例II)。在CIN2病变中在细胞质和细胞核中的颗粒染色图案相当于HPVmRNA表达， 类似于CIN3病变中观察到的图案（参见实施例II)。CIN2病变中杂种染色图案的观察结 果很可能与过渡HPV感染状态相关，其中HPV感染从能够自我清除的瞬时感染过渡到如在 CIN3病变中反映出的持续HPV感染。本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类为相当 于过渡HPV感染状态的过渡状态，过渡HPV感染状态具有增加的过渡到持续HPV感染状态 的可能性。这是特别有用的，因为CIN2病变仅通过组织学进行分类是最困难的。通过基于 HPV感染状态鉴别和分类CIN2病变，本发明的方法可以用于基于宫颈样品表现出过渡HPV 感染状态的可能性客观地鉴别宫颈样品并将其分层，过渡HPV感染状态具有增加的过渡到 持续HPV感染状态的可能性。因此，本发明的方法对于基于高危HPV亚型的E6和/或E7 的活跃转录（mRNA的存在）的检测将CIN2病变分层为是更像CIN1状态（即，表现出CIN2 病变的组织学但有瞬时HPV感染状态的HPV核酸染色图案）的宫颈样品，还是更有可能进 展到CIN3病变的持续状态的CIN2病变的宫颈样品特别有用。
[0048] 如本文所公开的，本发明的方法涉及基于宫颈细胞的HPV感染状态将宫颈样品分 类。基于宫颈细胞的感染状态，本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，即通过检测仅 仅在宫颈组织样品的上皮的浅表层中的HPVDNA，其指示低级别病变。如本文所描述的，仅 在宫颈组织样品的上皮的浅表层中检测到丰富HPVDNA与瞬时HPV感染状态和CIN1病变 相关。这样的瞬时HPV感染状态或CIN1样病变被认为是低级别病变，如本文所公开的。
[0049] 在另一个实施方式中，本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，即通过检 测宫颈组织样品的上皮的浅表层、中间层和/或基底层中，特别是中间层和/或基底层 中的HPVRNA，其指示高级别病变。如本文所公开的，在宫颈上皮的各层中均检测到HPV RNA(mRNA)与持续HPV感染状态和CIN3病变相关。这样的持续HPV感染和CIN3样病变被 认为是高级别病变，如本文所公开的。
[0050] 在又一个实施方式中，本发明的方法可以用于将宫颈组织样品分类，即通过检测 宫颈组织样品的上皮的基底层或中间层中的HPVRNA和宫颈组织样品的上皮的浅表层中的 HPVDNA，其指示高级别病变。如本文所公开的，在宫颈组织样品的上皮的中间层中检测到 HPVRNA和在宫颈组织样品的上皮的浅表层中检测到HPVDNA与过渡HPV感染状态和CIN2 病变相关。尽管这样的过渡HPV感染状态能被认为是处于CIN1和CIN3之间的中间状态 (杂种状态），但是本领域已知CIN2病变具有增加的过渡到CIN3级别的可能性并且常规 被指派为高级别病变（参见表1和参考文献如Sellors和Sankaranarayanan，同上，2003 ; Kalaf和Cooper，同上，2007;Brown和Trimble，同上，2012;Waxman等人，同上，2012)。因 此，即使在宫颈组织样品的上皮的中间层中检测到HPVRNA和在宫颈组织样品的上皮的浅 表层中检测到HPVDNA与过渡HPV感染状态相关，但是这种杂种或中间状态仍然被认为是 高级别病变，其与CIN2病变的已知状态和与活跃HPVE6/E7mRNA表达的存在相一致。
[0051] 如本文所公开的，HPVRNA(mRNA)在CIN2和CIN3病变中被检出，指示这些病变活 跃地转录E6和/或E7mRNA。相反，仅HPVDNA或占优势地的是DNA在CIN1病变中被检出。 因此，在宫颈组织样品中HPVRNA的存在与CIN2和CIN3病变相关，它们二者均被归类为高 级别病变。因此，本发明的方法可以用于基于HPVRNA(mRNA)的检测将宫颈组织样品分类 或归类为指示高级别病变。
[0052] 如本文所公开的，本发明的方法有利地允许同时检测HPVDNA和HPVRNA。用于 检测宫颈样品中的HPV的先前方法没有涉及使用相同检测方法同时检测相同样品中的HPV DNA和HPVRNA。如果HPVDNA和HPVRNA在相同样品中被检出，一般采用不同检测方法来 最优化DNA或RNA的检测。这一般被认为是重要的，因为甚至低拷贝数HPVDNA的检测能 够与了解宫颈组织样品病变的病理学有关。本发明的方法可以有利地用于以高灵敏度同 时检测HPVDNA和HPVRNA，从而如本文所公开的允许将宫颈组织样品归类，并且也增加了 HPV检测的灵敏度。因此，本发明的一个实施方式包括同时检测HPVDNA和HPVRNA二者的 能力，当它们二者同时存在于宫颈组织样品中时。因此，检测HPV核酸的存在可以包括检测 HPVDNA和HPVRNA。在一个特定的实施方式中，反义E6和/或E7探针能检测探针组中的 高危型HPV，选自HPV亚型 16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和 82 中的一种或多种。
[0053] 进一步如本文所公开的，本发明的能同时检测HPVDNA和HPVRNA二者的方法可 以包括样品在进行原位杂交测定之前的预处理步骤以使双链DNA变性。这个步骤可以用于 增加或最优化HPVDNA的检测，即通过产生至少部分变性的单链段DNA，其能与HPV靶探针 更有效地杂交。用于处理宫颈细胞学样品使HPVDNA至少部分变性的方法为本领域所熟知， 如本文所公开的。应当理解，这样的方法能导致样品中存在的实质上所有的DNA的变性或 者使样品存在的DNA部分变性，以便增加靶探针与HPVDNA结合的效率。本领域技术人员 能够容易地确定样品中DNA的至少部分变性至实质上完全变性足以提供HPVDNA检测的适 当条件。
[0054] 如本文所描述的，本发明的方法利用反义探针同时检测HPVDNA和HPVRNA，如果 存在的话。本发明的方法能任选地包括使用有义探针使平行样品杂交以鉴别和/或确认HPVDNA的检测（参见实施例I和II)。因此，利用有义探针的平行测定能任选地用在本发 明的方法中。在这样的情况下，有义探针将一般是针对与在反义探针中使用的HPV亚型或 HPV亚型池相同的一组靶探针。本发明的方法能任选地进一步包括将样品与DNase和/或 RNase-起孵育以确认被测HPV核酸是HPVDNA还是HPVRNA的测定，如有需要。此外，应 当理解，HPVDNA和/或RNA的水平可以使用众所周知的测定条件进行定量，以定量测定原 位杂交测定中的被测信号。因此，本发明的方法能利用HPVDNA和/或RNA表达图案，组织 样品中HPVDNA或RNA表达的空间取向，或HPVDNA和/或RNA表达的水平，或它们的组合， 来确定关于宫颈样品的HPV感染状态的有关信息。
[0055] 如本文所公开的，本发明的方法提供基于HPVDNA和/或mRNA(如果存在的话） 的检测将宫颈组织样品分类的能力，并且另外还利用HPVDNA和/或mRNA的空间表达图案 以将宫颈组织样品进一步分类。HPVDNA和/或mRNA表达图案已在宫颈上皮不同层中观察 至IJ，这取决于宫颈病变的CIN种类，特别是在宫颈组织的上皮的浅表层、中间层和/或基底 层中的表达，例如，在上皮的中间层和/或基底层中的表达。本领域技术人员将容易地理解 基于宫颈组织的熟知解剖学和组织学，宫颈组织上皮各层的含义。
[0056] 举例说明，图7显示正常宫颈上皮已知结构的示意图。浅表层由几层不大贴壁的 细胞组成，一般比中间层的更宽和更薄。中间层，也称为中央带或副基底带，由成熟鳞状细 胞组成，它具有比基底层的更丰富的细胞质。有的时候，中间层进一步分层为副基底层和更 成熟鳞状上皮细胞。如本文所用的，术语"中间层"包括副基底层和更成熟鳞状上皮细胞， 即在基底层和浅表层之间的层。基底层，也称为基底带，是单层柱状细胞，其主要功能是上 皮再生。图7意欲说明宫颈组织的上皮的浅表层、中间层和基底层的一般位置，并且本领域 技术人员、特别是临床医师或病理学家将容易地理解如本文所用的宫颈组织的上皮的浅表 层、中间层和基底层的含义。
[0057] 如本文所描述的，本发明的方法可以用于确定关于宫颈组织样品的HPV感染状态 的有帮助的信息，并且基于高危型HPVDNA和/或mRNA的表达图案的空间取向进行分类， 特别是如宫颈上皮的特定各层所确定。本发明的方法也可以用于将宫颈细胞学样品分类， 甚至在不存在HPVDNA和/或mRNA的表达图案的空间信息的情况下。如本文所公开的，用 Caski细胞作为一种模型以表征在不存在组织结构（如组织活检）的情况下，HPVDNA和 mRNA在个体细胞中的表达。Caski细胞是已知携带HPV16的宫颈细胞系。如本文所公开 的，可以用HPV-16有义和反义探针来检测个体细胞中的HPVDNA和mRNA。个体细胞中HPV DNA和mRNA的检测指示本发明的方法能够容易地应用于细胞学样品如由宫颈细胞刮擦所 获得的宫颈细胞，例如，如用Pap涂片所获得的。
[0058] 在一个另外的实施方式中，本发明提供将宫颈细胞学样品分类的方法。该样品可 以在常规宫颈检查程序如Pap涂片或类似技术中获得。所采集的宫颈细胞可以直接在采集 地点涂抹在显微镜载玻片上，或者作为在防腐保存缓冲液（即，液体Pap)的悬浮细胞收集， 并且后者使用本领域已知的方法沉积在载玻片上。该方法可以包括使用反义E6和/或E7 探针在宫颈细胞学样品上进行原位杂交测定，其中反义E6和/或E7探针能同时检测HPV DNA和HPVRNA;检测HPV核酸的存在；和将宫颈细胞学样品分类，其中仅在宫颈细胞样品 中HPV核酸的扩散核染色的存在指示瞬时状态，其中在宫颈细胞学样品中在细胞质和细胞 核中HPV核酸的颗粒染色的存在指示持续状态，或其中在宫颈细胞学样品的细胞质和细胞 核中HPV核酸的扩散核染色和HPV核酸的颗粒染色的存在指示过渡状态。
[0059] 与使用宫颈组织样品的方法类似，将宫颈细胞学样品分类的方法可以用于确定相 当于瞬时HPV感染状态的瞬时状态。如本文所公开的，CIN1病变的细胞表现出仅HPVDNA 的染色。因此，表现出仅HPVDNA的染色和特别是扩散核染色的宫颈细胞学样品（如含有 宫颈细胞的宫颈细胞刮擦物）被认为相当于瞬时HPV感染和低级别病变（CIN1样病变）。
[0060] 在将宫颈细胞学样品分类的方法的另一个实施方式中，HPVmRNA表达的检测指示 高级别病变。在观察到颗粒状细胞核和细胞质HPV核酸染色的情况下，这样的样品被认为 代表HPVmRNA的表达且相当于高级别病变。在这样的样品中，在代表性细胞学样本中的细 胞表现出细胞核和细胞质mRNA表达的情况下，该样品被认为与高级别CIN3样病变相关。在 代表性细胞学样本中的细胞表现出细胞核和细胞质mRNA表达的情况下，样品被认为相当 于持续HPV感染状态的持续状态。
[0061] 在将宫颈细胞学样品分类的方法的又一个实施方式中，在相同细胞学样品里面细 胞中的颗粒状细胞核和细胞质HPV核酸染色和扩散核染色二者的检测相当于过渡状态，类 似于通过宫颈组织分析观察到的CIN2状态，相当于HPV感染状态，其具有增加的过渡到持 续HPV感染状态的可能性。在本发明的方法中，在宫颈细胞学样品中观察到的HPVRNA的 检测指示高级别病变。与宫颈组织样品分析类似，HPVE6和/或E7mRNA的表达是HPVE6 和/或E7活跃转录的指标并且相当于高级别病变。在宫颈细胞学样品中HPVRNA和HPV DNA的检测也指示高