有需要。本 领域技术人员将容易地理解，用于将样品中的双链变性的特定温度的选择可以变化，这取 决于用于变性步骤的缓冲液条件，包括但不限于盐和/或离液试剂（chaotropicagents) 的存在，等等。例如，在化学变性试剂的存在下，一般可以使用较低孵育温度，正如本领域 众所周知的。类似地，本领域技术人员可以改变进行预处理步骤以实施双链DNA的至少部 分变性的时间长度。例如，预处理步骤可以进行约1分钟至约1小时，或更长时间，如有需 要。具体地说，预处理步骤进行至少5分钟至60分钟，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60分钟，如有需要。也 可以使用更长的孵育时间，例如，1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16小时，例如，过夜或更长时间，如有需要，特别是当使用较低温度时。在一个特定的实 施方式中，预处理步骤在约100 °C的温度下进行5-60分钟，特别是5分钟、10分钟、15分 钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟，例如，5_55、5_50、 5-45、5-40、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、 10-30、10-25、10-20、10-15、15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25、 15-20、20-60、20-55、20-50、20-45、20-40、20-35、20-30、25-60、25-55、25-50、25-45、 25-40、25-35、25-30、30-60、30-55、30-50、30-45、30-40、30-35、35-60、35-55、35-50、 35-45、35-40、40-60、40-55、40-50、40-45、50-60、50-55、55-60 分钟，等等，如有需要。
[0087] 对于该方法的所有或大部分步骤，为了易于处理，可以将宫颈细胞学样品用作细 胞悬液。一般而言，该方法也应用于固体组织样品（例如，组织活检样品或组织切片）中的 宫颈细胞样品和/或固定在基底（例如，载玻片或其它表面）上的细胞学样品的细胞并且 对于分析它们特别有用。
[0088] 在本发明的一个实施方式中，本文公开的ISH方法可以使用有区别的酶或非酶标 记，允许可区别的可检测标记与特定靶核酸的缔合。例如，可以用可区别的标记来检测HPV靶探针组中的每一种HPV亚型。在另一个实施方式中，用不可区别的标记即相同的标记来 检测所有HPV靶探针，从而检测样品中的HPV亚型中的任何一种。因为探针组含有高危HPV 亚型，所以检测样品中的高危HPV亚型中的任何一种或多种对于与本发明的方法相关的分 析来说是足够的。因此，一般而言，用相同标记探针来检测样品中存在的任何和所有HPV亚 型。
[0089] 可以使用多种酶或非酶标记中的任何一种，只要酶促活性或非酶标记可以分别被 检出。酶由此产生可检测信号，其可以用于检测靶核酸。特别有用的可检测信号是显色或 发荧光信号。因此，特别有用的用作标记的酶包括显色或发荧光底物可获得的那些。这样 的显色或发荧光（fluorgenic)底物可以通过酶促反应转化成容易检测的显色或荧光产 物，其可以使用显微镜术或光谱学容易地检测和/或定量。这样的酶为本领域技术人员所 熟知，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等（参见 Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)) 〇 具有熟知的 显色或发荧光（fluoregenic)底物的其它酶包括各种肽酶，其中显色或发荧光肽底物可以 用于检测蛋白酶切割反应。显色和发荧光底物的应用在细菌诊断中也是众所周知的，包括 但不限于α-和β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸糖苷酶、6-磷酸-β-D-半乳糖苷-6-磷 酸半乳糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等的 应用（Manafi等人，Microbiol.Rev. 55:335-348 (1991))，并且这样的具有已知显色或发荧 光底物的酶能够容易地改变以用在本发明的方法中。
[0090] 各种产生可检测信号的显色或发荧光底物为本领域技术人员所熟知并且是在商 业上可获得的。可以用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于3, 3' -二氨基联苯胺 (DAB)、3, 3 '，5, 5 ' -四甲基联苯胺（TMB)、氯萘酚（4-CN) (4-氯-1-萘酚）、2, 2' -连氮基-双 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS)、邻-苯二胺二盐酸盐（0PD)和3-氨基-9-乙基咔 唑（AEC)，对于辣根过氧化物酶；5-溴-4-氯-3-B引哚基-1-磷酸酯（BCIP)、硝基蓝四唑翁 盐（NBT)、坚牢红（FastRed)(FastRedTR/AS-MX)和磷酸对-硝基苯酯（PNPP)，对于碱性 磷酸酶；1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基）苯基 β-D-吡喃半乳糖苷，对于β-半乳糖苷酶；2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基）苯基β-D-吡喃 葡萄糖苷，对于β-葡萄糖苷酶；等等。示例性的发荧光底物包括但不限于4-(三氟甲基） 伞形基（umbelliferyl)磷酸酯，对于碱性磷酸酶；4-甲基伞形基磷酸酯双（2-氨基-2-甲 基-1，3-丙二醇）、4_甲基伞形基磷酸酯双（环己铵）和4-甲基伞形基磷酸酯，对于磷酸 酶；QuantaBlu?和QuantaRed?，对于辣根过氧化物酶；4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖 苷、荧光素二（β-D-吡喃半乳糖苷）和萘荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷），对于β-半 乳糖苷酶；3-乙酰基伞形基β-D-吡喃葡萄糖苷和4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡萄糖苷， 对于β-葡萄糖苷酶；和4-甲基伞形基-a-D-吡喃半乳糖苷，对于α-半乳糖苷酶。用 于产生可检测信号的示例性酶和底物也描述于例如美国公布2012/0100540。各种可检测 酶底物包括显色或发荧光底物是众所周知的并且是在商业上可获得的（Pierce，Rockford IL；SantaCruzBiotechnology,DallasTX；Invitrogen,CarlsbadCA；42LifeScience； Biocare)。一般而言，将底物转变成产物，产物形成沉淀物，沉淀物沉积在靶核酸的位点上。 其它不例性的底物包括但不限于HRP_Green(42LifeScience)、BetazoidDAB、Cardassian DAB、RomulinAEC、拜卓紫（BajoranPurple)、维娜绿（VinaGreen)、DeepSpaceBlack?、 WarpRed?、VulcanFastRed和FerangiBlue(来自Biocare)(ConcordCA;biocare.net/ products/detection/chromogens) 〇
[0091] 生物素-抗生物素蛋白（或生物素-链霉抗生物素蛋白）是众所周知的信号放大 系统，基于这两个分子彼此具有超常的高亲和力并且一个抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋 白分子可以结合四个生物素分子的事实。抗体广泛用于免疫组织化学和ISH中的信号放 大。酪酰胺信号放大（Tyramidesignalamplification,TSA)基于通过过氧化物酶活性使 大量半抗原化酪酰胺分子沉积。酪胺是一种酚类化合物。在少量过氧化氢的存在下，固定 化辣根过氧化物酶（HRP)将经标记的底物转变成短寿命的极具反应性的中间体。然后，被 激活的底物分子与蛋白质的富电子部分（如酪氨酸）在过氧化物酶结合位点处或其附近非 常快速地反应并且与其共价结合。以这种方式，可以在原位杂交位点引入与酪酰胺缀合的 许多额外半抗原分子。随后，沉积的酪酰胺-半抗原分子可以直接地或间接地显现。这样 的检测系统例如在美国公布2012/0100540中有更详细描述。
[0092] 使用适当的显色或发荧光底物，本文描述的实施方式可以利用酶来产生可检测 信号。应当理解，可选地，标记探针可具有直接与标记探针的核酸部分偶联的可检测标 记。示例性的可检测标记为本领域技术人员所熟知，包括但不限于显色或荧光标记（参 见Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)) 〇 可用作标 记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如，四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、 磺基罗丹明B、德克萨斯红（TexasRed)(磺基罗丹明101)、罗丹明110及其衍生物（如四 甲基罗丹明-5_(或6))、丽丝胺罗丹明B等；7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑（NBD);荧 光素及其衍生物；萘，例如丹磺酰基（5-二甲基氨基萘-1-磺酰基）；香豆素衍生物，例如 7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（AMCA)、7-二乙基氨基-3-[(4'_(碘乙酰基）氨基）苯 基]-4-甲基香豆素（DCIA)、Alexafluor染料（MolecularProbes)等；4, 4-二氣-4-硼 杂 _3a, 4a_ 二氮杂-S-讳（B0DIPY?)及其衍生物（MolecularProbes;EugeneOreg.);花 和磺酸化芘，例如CascadeBlue?及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1，3, 6-三磺酸等；吡啶基 嚼P坐衍生物和dapoxyl衍生物（MolecularProbes);萤光黄（LuciferYellow) (3, 6_ 二横 酸酯-4-氨基-萘酰亚胺）及其衍生物；CyDye?焚光染料（Amersham/GEHealthcareLife Sciences;PiscatawayNJ)等。示例性的生色团包括但不限于酸酞、孔雀绿、硝基芳族化合 物（如硝基苯）、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4' -磺酰基）等。
[0093] 可以用熟知的方法如显微镜术或光谱学来显现与相应靶核酸相关的显色或荧光 可检测信号。一般而言，对于特殊测定将使用或显色底物或发荧光底物，或显色或荧光标 记，如果在同一测定中使用不同标记的话，使得可以在相同样品中使用单一类型的仪器进 行核酸靶的检测。
[0094] 在一个实施方式中，标记探针直接与靶核酸分子杂交。如上所讨论的，在这样的实 施方式中，标记探针本身包含核酸靶结合区（如互补寡核苷酸），并且直接与靶核酸结合。 可选地，使用中间复合物，标记探针可以间接与靶核酸结合（也参见W0 2013/134442和TO 2013/152295)。在一个这样的实施方式中，中间复合物可以是单个分子如单个核酸分子。 例如，作为单个分子的中间复合物可以包含能够与靶核酸特异性和选择性连接或结合的区 域。这类似于经设计连接或结合至靶核酸的标记探针，只是与核酸靶结合由中间分子介导。 中间分子也可以包含能够与标记探针特异性和选择性结合的区域。在这样的情况下，标记 探针和中间分子被设计成具有彼此互补的结合区（如寡核苷酸区）。这样的构型因而使酶 标记通过中间分子与靶核酸特异性和选择性缔合。第二靶核酸可以通过第二中间复合物与 相同标记或区别标记特异性和选择性缔合。第二中间复合物包含能够与靶核酸特异性和选 择性结合的第一区域和能够与相同标记探针或第二标记探针特异性和选择性结合的第二 区域。因此，标记探针可以通过第一和第二中间复合物与靶核酸分子结合。进一步，中间复 合物可以包含包含与靶核酸互补的第一区域的分子并且包含与标记探针互补的至少一种 第二区域的相同或不同分子。再进一步，中间复合物可以包含组装的多个分子，其中一种或 多种组分各自包含与靶核酸互补的一个或多个区域，并且一种或多种其它组分各自包含与 标记探针互补的一个或多个区域。以这种方式，中间复合物可以是放大结构，允许多个标记 探针与靶核酸上的区域连接。一般而言，中间复合物包含一种或多种核酸分子以利用核酸 相互作用的特异性和选择性结合能力。
[0095] 如本文所描述的，可以使样品与相同或有区别的标记探针接触，如本文所公开的。 标记探针通过靶核酸上的互补区和标记探针或中间复合物的杂交与靶核酸分子结合，如本 文所讨论的。
[0096] 如本文所描述的，在本发明的方法中使用的标记探针可以包含含有寡核苷酸的 靶核酸结合区，寡核苷酸与靶核酸互补或与可以结合至靶核酸的中间复合物的组分互 补。在标记探针的这种构型中，寡核苷酸部分与酶或非酶标记偶联。酶或非酶标记与标 记探针中的寡核苷酸的偶联可以是共价的，使用众所周知的化学偶联方法（参见例如， Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)) 〇 可选地，高 亲和力相互作用（如生物素/抗生物素蛋白，其中生物素或抗生物素蛋白与寡核苷酸和标 记探针中的酶或非酶标记偶联），可以用于使酶或非酶标记与标记探针中的寡核苷酸偶联 (参见美国公布2012/0100540)。应当理解，酶或非酶标记与标记探针中的寡核苷酸的偶联 具有足够的亲和力，如通过相互作用（如生物素/抗生物素蛋白），或为共价的，使得酶或非 酶标记保留通过本发明的方法的各种反应和测定条件与寡核苷酸连接。
[0097] 在又一个实施方式中，本发明的方法可以使用中间复合物，其中中间复合物 包含多种分子而不是单一分子。这样的中间复合物对于放大可检测信号、提供靶核 酸的更高灵敏度检测特别有用。这样的用于放大信号的方法描述于例如美国专利号 5, 635, 352、5, 124, 246、5, 710, 264、5, 849, 481 和 7, 709, 198 及美国公布 2008/0038725 和 2009/0081688,以及TO2007/001986 和TO2012/054795。
[0098] 因此，在一个特定的实施方式中，中间复合物可以包含靶探针、放大子和辅放大 子。另外，多个标记探针可以与一个或多个放大子杂交，多个放大子可以与辅放大子杂交， 并且辅放大子可以与靶探针杂交。
[0099] 在再一个实施方式中，可以使用构型，其中中间复合物包含靶探针、辅放大子和放 大子。不使用单一靶探针使辅放大子与靶核酸结合，而是使用两个或两个以上靶探针使 辅放大子与靶核酸结合。一般而言，这样的构型的优点可以使用两种靶探针来实现，即， 使用一对靶探针使辅放大子与靶核酸结合。这样的构型及其用于增加灵敏度和减少背 景的优点描述于例如美国专利号7, 709, 198、美国公布2008/0038725和2009/0081688， 及TO2007/001986、W0 2007/002006、W0 2013/134442 和W0 2013/152295。美国专利号 7, 709, 198和美国公布2008/0038725和2009/0081688另外还描述了用于选择靶探针（包 括靶探针对）的特征的细节，包括长度、取向、杂交条件等，如下文更详细讨论的。
[0100] 本领域技术人员应该理解，许多合适样品中的任何一种都可以用于使用本发明的 方法检测靶核酸。在本发明的方法中使用的样品将一般是生物学样品或组织样品。这样的 样品可以得自生物学对象，包括从个体采集的生物学组织或体液来源的样品，或生物学材 料的一些其它来源如活检样品。生物学样品也包括来自生物学对象的含有或怀疑含有宫颈 病变、癌前期或癌细胞或组织的区域的样品，例如，组织活检、宫颈细胞涂片（Pap涂片）。这 样的样品可以是但不限于从生物体如哺乳动物、特别是人分离的组织、组织碎片和/或细 胞。在一个特定的实施方式中，组织切片是福尔马林固定的、石蜡包埋的（FFPE)。
[0101] 样品或生物学样本可以通过用于处置生物学样品的多种常规方法中的任一种进 行加工。例如，可以将细胞分离或加工例如作为组织薄切片或其它组织样本，包括固定 细胞，例如用福尔马林固定的和石蜡包埋的（FFPE)组织、新鲜冷冻组织、白细胞等。用 于加工宫颈样品的方法为本领域所熟知（参见Sellors和Sankaranarayanan，同上， 2003)。用于加工组织或细胞样品进行原位杂交的方法为本领域技术人员所熟知（参 见例如，Stoler,ClinicsinLaboratoryMedicine10(1):215-236(1990);Insitu hybridization.Apracticalapproach,Wilkinson编著,IRLPress,Oxford(1992)； Schwarzacher和Heslop-Harrison,Practicalinsituhybridization,BIOSScientific PublishersLtd,Oxford(2000);)。用于加工样品进行宫颈组织包括组织活检和细胞学 样品的分析的方法为本领域所熟知（参见例如，CecilTextbookofMedicine,Bennett 和Plum编著，第 20 版，WBSaunders,Philadelphia(1996);ColposcopyandTreatment ofCervicalIntraepithelialNeoplasia:ABeginner'sManual(宫颈上皮内瘤变的 阴道镜检查和治疗：初学者手册），Sellors和Sankaranarayanan编著，International AgencyforResearchonCancer,Lyon,France(2003)；Kalaf和Cooper,J.Clin. Pathol.60:449-455 (2007);Brown和Trimble,BestPract.Res.Clin.Obstet. Gynaecol. 26:233-242(2012);Waxman等人，Obstet.Gynecol. 120:1465-1471(2012); CervicalCytologyPracticeGuidelinesTOC,ApprovedbytheAmericanSocietyof Cytopathology(ASC)ExecutiveBoard,NovemberlO, 2000))〇
[0102] 如本文所公开的，本发明的方法为检测相同样品中的多种靶核酸、特别是高危HPV 亚型提供了一种方便测定方法。除了指导标记探针与酶或非酶标记的偶联以外，在另一个 实施方式中，抗体可以用作中间物以标记靶核酸。用于同时检测两种DNA靶的方法（如双 色显色ISH(CISH)测定）先前已有描述（US2011/033176)，其中将针对两个不同基因的探针 与半抗原如地高辛（DIG)或二硝基苯（DNP)缀合。然后，使用与诸如辣根过氧化物酶和碱 性磷酸酶等不同酶缀合的抗DIG抗体和抗DNP抗体或其它合适的抗半抗原抗体来产生不同 颜色的沉淀物。尽管该测定法允许两种靶标的显现，但是该显现使用一种抗体使酶与靶核 酸结合来发生。这样的基于抗体的ISH测定能同样地适用于本发明的方法，如本文所公开 的。
[0103] 如本文所公开的，通过利用包含核酸的标记探针与靶核酸结合，通过使用适当的 在计算机芯片上（insilico)寡核苷酸设计和通过选择和控制杂交条件，使用众所周知的 方法，可以实现特异性和选择性的高水平。这样的系统可以对选择性和特异性进行最优化 并且对核酸靶之间的非特异性结合最小化。
[0104] 本发明另外还提供试剂盒，其包含进行本发明的方法的组分。在一个实施方式 中，本发明提供用于检测如本文所公开的高危HPV亚型的试剂盒，包括针对HPV亚型的反 义和有义探针。该试剂盒可以含有多种进行RNA原位杂交测定的试剂，包括经设计以与 一种或多种HPV亚型杂交的至少一个探针组；和信号放大系统。一般而言，这样的试剂盒 将在合适的容器中提供。任选地，该试剂盒可以还包含至少一个阴性对照探针组。在一 个特定的实施方式中，该试剂盒含有多种用于进行如本文所公开的和先前描述的原位杂 交测定如RNAscope?测定的试剂（美国专利号7, 709, 198、美国公布2008/0038725和 2009/0081688 和TO2007/001986 和TO2007/002006)。
[0105] 这样的试剂盒除了包括以上描述的组分以外，还能够任选地包括例如标记探针、 放大子、辅放大子、靶探针等。这样的组分可以设计为用于本文公开的构型中的任一种。本 发明的试剂盒可以例如包含标记探针，标记探针包含相同标记或有区别的标记，如果标记 包括酶、用于酶的合适的显色或发荧光底物，用于实现本发明的方法。该试剂盒可以含有非 靶特异性组分，该组分可以用于检测任何期望靶核酸，用由试剂盒的用户分开设计的靶特 异性结合组分，例如针对高危HPV亚型的探针，如本文所公开的。可选地，该试剂盒可以设 计为含有包括一种或多种特定靶核酸如高危HPV亚型的结合剂的组分。该试剂盒可以另外 包括使用试剂盒的组分以实现本发明的方法的说明书。
[0106] 如本文所描述的，本发明的实施方式可以包括靶探针的用途。这样的构型 及其用于增加灵敏度和减少背景的优点描述于例如美国专利号7, 709, 198、美国公 布 2008/0038725 和 2009/0081688 及W0 2007/001986 和W0 2007/002006。美国专利 号7, 709, 198和美国公布2008/0038725和2009/0081688另外还描述了用于选择靶探 针（包括靶探针对）的特征的细节，包括长度、取向、杂交条件等。本领域技术人员能 够基于 7, 709, 198、美国公布 2008/0038725 和 2009/0081688 及W0 2007/001986 和TO 2007/002006中的教导容易地鉴定合适的构型。在下面提供的描述中，基于本文中的公 开内容和 7, 709, 198、美国公布 2008/0038725 和 2009/0081688