一种羧甲基化梭柄松苞菇多糖的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及多糖的制备技术领域，具体为一种簇甲基化梭柄松巷茹多糖（cCVPs) 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组W高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于膜岛素分泌缺陷或 其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、 肾、屯、脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。根据世界卫生组织在2014年公布的数据，全球 糖尿病患者人数已经达到3. 47亿。
[0003] 具有药用价值的食用真菌在传统民间药物中被认为是非常重要的治疗药物之一， 并且应用非常普遍。研究表明，食用真菌对疾病的治疗主要是由于它所含有生物活性物质 所引起的。运些食用真菌的活性物质可W使糖尿病患者的肝脏、膜腺等脏器功能恢复正常， 从而促进膜岛素和相关激素的分泌，使得机体的代谢功能恢复。
[0004] 多糖具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等药用活性，将多糖簇甲基化之后显著 增加多糖的生物活性，并且还会增加多糖的水溶性和粘稠性，在食品、药剂配方、工业原料 中被广泛使用。而现阶段多糖簇甲基化的方法普遍存在：簇甲基化多糖取代度较低，并且在 增加试剂浓度和反应时间时，又会严重影响簇甲基化多糖的得率。目前并没有利用梭柄松 巷茹多糖进行簇甲基化的研究，值得注意的是梭柄松巷茹多糖的分子量较其他菌类多糖而 言较小，而分子量的大小往往与取代度和生物活性成反比，因此用簇甲基化的梭柄松巷茹 多糖应用于抗糖尿病的研究必将会为多糖的化学修饰和多糖的生物活性提供新思路和参 考。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种W梭柄松巷茹为代表的高效的食用菌多糖簇甲基化 的方法，，W解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种簇甲基化梭柄松巷茹多糖的制 备方法，其特征在于：（1)取新鲜梭柄松巷茹进行预处理；（2)梭柄松巷茹多糖的制备，具 体为：水提取：先用乙醇进行洗涂，然后离屯、处理，将离屯、管的沉淀样品干燥，并按料液比 1 : 20与蒸馈水混合，然后进行超声波处理，超声波作用功率为150W，每工作15min，暂停 5min，提取溫度80°C，提取时间2.化，上述水提取步骤重复提取=次，合并提取液即为梭柄 松巷茹多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松巷茹多糖提取液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积 的95 %乙醇溶液，揽拌0.化后，置于4°C冰箱12h，再离屯、处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻 干待用；去除蛋白质：按固液比1 : 10加入蒸馈水溶解梭柄松巷茹多糖，然后加入1/4倍体 积的氯仿-正下醇，充分振荡30min后，再离屯、处理，获得=层液体，吸取最下层多糖溶液， 重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜， 透析袋的截留分子量为3000,W去除小分子杂质；再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩， 与4倍体积的95%乙醇溶液混合，揽拌0.化后，置于4°C冰箱12h，再离屯、处理，离屯、机转 速5000巧m，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松巷茹多糖，冷冻干燥备用；（3)簇甲基化 梭柄松巷茹多糖的制备，具体为：取分子量范围为5. 0XIO3-L0XIO4Da的250mg梭柄松巷 茹多糖溶于IOml质量分数为20%的化OH溶液中，充分揽拌混合液30min，加入3g氯乙酸 和15ml的异丙醇的混合溶液，揽拌Ih后，置于65°C的恒溫箱中反应也待冷却至室溫，用 0. 5M的肥1调抑至中性，流水透析过夜，透析袋的截留分子量为3000,与4倍体积的95% 乙醇溶液混合，揽拌30min后，置于4°C冰箱12h，再离屯、，弃上清液，冷冻干燥即得到簇甲基 化梭柄松巷茹多糖。
[0007] 进一步的，新鲜梭柄松巷茹的预处理步骤具体为，
[0008] 清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松巷茹表面的泥溃去除，不可用水清洗，不然表面的 多糖会损失；
[0009] 切块：将清洁后的新鲜梭柄松巷茹切块，每一个切块大小适中且均匀；
[0010] 冷冻干燥：将梭柄松巷茹块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。
[0011] 进一步的，乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤中的离屯、处理的离屯、机转速SOOOrpm, 时间5min。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1)本专利选用的原料（梭柄松巷茹）在 四川、云南和贵州等地广泛种植，采集方便，价格低廉，并且CVPs已经被证明具有较为突出 的抗糖尿病活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；（2)本专利建立了一种高效的cCVPs 的制备方法，其中首次评价了多糖分子量范围对多糖簇甲基化的影响，最终所得cCVPs的 得率和取代度分别达到了 82. 01%和0. 891。并且整个制备过程的反应条件溫和，成本低 廉，操作简单易于工业推广；（3)动物实验证明，对CVPs进行簇甲基化修饰后，cCVPs的生物 活性得到显著提高，仅需摄入0. 2g/kg/d剂量的cCVPs，便能够显著提高糖尿病小鼠血清中 各氧化剂的水平，W缓解其氧化应激水平，从而实现对糖尿病的治疗。
【附图说明】
[0013]图1为本发明中簇甲基化梭柄松巷茹多糖红外光谱图；
【具体实施方式】
[0014] 下面将结合本发明实施例中的附图1，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0015] 请参阅图1，本发明提供一种簇甲基化梭柄松巷茹多糖的制备方法，其特征在于： (1)取新鲜梭柄松巷茹进行预处理；清洁：用塑料刮片将新鲜梭柄松巷茹表面的泥溃去除， 不可用水清洗，不然表面的多糖会损失；切块：将清洁后的新鲜梭柄松巷茹切块，每一个切 块大小适中且均匀；冷冻干燥：将梭柄松巷茹块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样 品。（2)梭柄松巷茹多糖的制备，具体为：水提取：先用乙醇进行洗涂，然后离屯、处理，将离 屯、管的沉淀样品干燥，并按料液比1 : 20与蒸馈水混合，然后进行超声波处理，超声波作用 功率为150W，每工作15min，暂停5min，提取溫度80°C，提取时间2. 5h，上述水提取步骤重 复提取=次，合并提取液即为梭柄松巷茹多糖提取液；乙醇沉淀：将梭柄松巷茹多糖提取 液用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95 %乙醇溶液，揽拌0.化后，置于4°C冰箱12h，再 离屯、处理，然后弃上清液，收集沉淀，冻干待用；去除蛋白质：按固液比1 : 10加入蒸馈水 溶解梭柄松巷茹多糖，然后加入1/4倍体积的氯仿-正下醇，充分振荡30min后，再离屯、处 理，获得=层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该去除蛋白质步骤5次；去除小分子物质：将 去除蛋白质的多糖提物，流水透析过夜，透析袋的截留分子量为3000,W去除小分子杂质； 再用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，与4倍体积的95 %乙醇溶液混合，揽拌0.化后，置 于4°C冰箱12h，再离屯、处理，离屯、机转速5000巧m，时间5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松 巷茹多糖，冷冻干燥备用；（3)簇甲基化梭柄松巷茹多糖的制备，具体为：取分子量范围为 5. 0XIO3-L0XIO4Da的250mg梭柄松巷茹多糖溶于IOml质量分数为20%的化OH溶液中， 充分揽拌混合液30min，加入3g氯乙酸和15ml的异丙醇的混合溶液，揽拌Ih后，置于65°C 的恒溫箱中反应地，待冷却至室溫，用0. 5M的肥1调抑至中性，流水透析过夜，透析袋的截 留分子量为3000,与4倍体积的95%乙醇溶液混合，揽拌30min后，置于4°C冰箱12h，再离 屯、，弃上清液，冷冻干燥即得到簇甲基化梭柄松巷茹多糖。乙醇沉淀步骤和去除蛋白质步骤 中的离屯、处理的离屯、机转速5000巧m，时间5min。
[0016] 上述梭柄松巷茹多糖最优分子量范围5.OX103-1.OX104Da的确定方法如下：
[0017] (1)多糖酸水解：①取适量梭柄松巷茹多糖样品于具塞试管中，用0.Imol/LS氣 乙酸（TFA)溶解，然后在Iior条件下水解比，再用分子截留规格为5.0X102的透析袋对 该反应液进行透析，W去除=氣乙酸和其他杂质，并收集透析袋内液体，即为多糖水解液； ②除分子截留规格为1.0X106的透析袋直接对多糖水解进行透析外，其余规格的透析袋 均对上一次透析袋外的多糖水解液进行透析（透析袋规格：1. OX 106、5. OX 105、3. OX 105、 1. 0X105、5. 0X104、3. OXl〇4、l. 0X104、5. 0X103、3. OXl〇3、l.〇Xl〇3)，收集透析袋内的液 体，冻干后即获得多糖分子量分别为：> I. 0 X 1〇6、5.0 X l〇5-l. 0 X 1〇6、3.0 X105-5.0 X 1〇5、 1. OX 105-3. OX 105、5. OX 1〇4-1. OX 105、3. OX 104-5. OX 1〇4、1. OX 104-3. OX 1〇4、 5. OX l〇3-l. OX 104、3. OX 103-5. OX l〇3、l. OX 103-3. OX 1〇3,10组不同分子量范围的组分。 [001引（2)每个组分进行簇甲基化比较它们的取代度和得率。
[0019] 表1:分子量对多糖的簇甲基化取代度和得率的影响
[0020]
[0021] 每个数值均表示为=次测试的平均值+标准差（SD)，同一列中不同的字母表示 具有显著差异（P< 0. 05)
[0022]由表 1 可得，多糖的分子量为 5.OXl〇3-l. 0X104、3. 0X103-5.OXl〇3、 I.OX103-3.OXIO3的S组取代度显著高于其余组分（p< 0. 05)。而分子量为 3. 0X103-5. 0X1〇3、1. 0X103-3. 0X1〇3的两组得率显著低于其余组分（P< 0. 05)，因此最