足部和/或腿部的感觉改变或完全丧失。 患有晚期神经病变的糖尿病患者减弱所有敏捷-迟钝辨别的能力。患有神经病变的患者对 足部的任何创口或创伤可能会完全忽视数天或数周。并不少见的是，当事实上溃疡已存在 相当长的一段时间时，患有神经病变的患者才注意到溃疡"刚刚出现"。对于神经病变患者， 已表明严格的血糖控制可以减慢该疾病的进展。由于感觉降低，夏尔科（Charcot)足部畸 形也可能会发生。在其足部中具有"正常"感觉的人具有自动感觉何时太大的压力正施加 于足部区域的能力。一旦确定，我们的身体本能地移动位置以释放该应力。患有晚期神经 病变的患者会减弱感觉持续的压力损害的这种能力，因而，可以发生组织缺血和坏死，导 致例如足底溃疡。另外，在足骨中的微小骨折，如果未注意且未治疗，可能导致外形损伤、 慢性肿胀以及另外的骨隆起。微血管疾病是糖尿病患者的重大并发症之一，其还可以导致 溃疡形成。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由糖 尿病的神经和血管并发症引起的糖尿病性足溃疡和/或溃疡形成。
[0084] 示例性慢性伤口可以包括"创伤性溃疡"。创伤性溃疡的形成可以由于对身体的创 伤性损伤而导致发生。这些损伤包括例如，对动脉、静脉或淋巴系统的损害；对骨骼骨结构 的改变；组织层一表皮、真皮、皮下软组织、肌肉或骨的损失；对身体部位或器官的损害以 及身体部位或器官的损失。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口 的特征在于与身体的创伤性损伤有关的溃疡形成。
[0085] 示例性的慢性伤口可以包括"烧伤性溃疡"，其包括I度烧伤（即皮肤的表面变红 区域）；11度烧伤（除去水泡液以后可以自发治愈的起泡损伤部位）；ΙΠ 度烧伤（贯穿整 个皮肤的烧伤并且通常需要外科干预用于伤口愈合）；烫伤（可因滚烫的热水、油脂或散热 器液发生）；热烧伤（可因火焰发生，通常是深度烧伤）；化学烧伤（可由酸和碱引起，通常 是深度烧伤）；电烧伤（房屋周围的低电压或工作中的高压）；爆炸焰烧伤（通常是表面损 伤）；以及接触烧伤（通常是深度烧伤并且可由于消声器尾管、热熨斗和炉灶发生）。在某 些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与身体的烧伤性损 伤有关的溃瘍形成。
[0086] 示例性慢性伤口可以包括"血管炎溃疡"。血管炎溃疡还发生在下肢上并且是疼痛 的边缘尖锐的病变，其可以具有有关的可触诊紫癜和出血性水泡。胶原疾病、败血症以及各 种造血系统疾病（例如，血小板减少症、异常蛋白血症）可能是这种严重急性病症的原因。
[0087] 示例性慢性伤口可以包括坏疽性脓皮病。坏疽性脓皮病以小腿的单个或多个非常 痛的溃疡的形式存在。深红色至紫色的破坏边界包围化脓性中央缺损。活检不能揭示血管 炎。在一半患者中，它与全身性疾病如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎或白血病相关。在某些 实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与坏疽性脓皮病有关 的溃疡形成。
[0088] 示例性慢性伤口可以包括感染性溃疡。感染性溃疡在直接接种各种生物体后发 生并且可能与明显区域性腺病相关。实例是分枝杆菌感染、炭疽病、白喉症、皮炎芽生菌病 (blastomyosis)、孢子丝菌病、兔热病以及猫抓热。初期梅毒的生殖器溃疡通常无触痛，并 具有干净坚实的基础。软下疳和腹股沟肉芽肿的那些生殖器溃疡倾向于是粗糙、肮脏和更 加过度（extravagant)的病变。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性 伤口的特征在于与感染有关的溃疡形成。
[0089] 本文中使用的术语"裂开伤口"是指具有破裂或裂开的伤口，通常是手术伤口。在 某些实施方案中，提供了治疗未以预期速率愈合的伤口的方法，其中伤口的特征在于裂开。
[0090] 在一些实施方案中，目前公开的主题的组合物还可以包括一种或多种其它伤口愈 合剂，例如美国专利号8, 063, 023和8, 247, 384以及美国专利申请号US 1012/0289479中 描述的那些药剂（各通过引用的方式并入本文中），包括例如抗连接蛋白剂。
[0091] 在一些实施方案中，目前公开的主题的组合物还可以包括一种或多种其它抗OGT 剂。
[0092] 本文所用的术语"个体"包括人类个体和动物个体。因此，目前公开的主题提供了 兽医治疗用途。这样，目前公开的主题提供了对哺乳动物如人以及由于正濒临灭绝而重要 的那些哺乳动物如东北虎、具有经济重要性的动物如农场饲养的用于人类消耗的动物和/ 或对人类有社会重要性的动物如作为宠物或在动物园饲养的动物的治疗。这类动物的实例 包括但不限于：肉食动物如猫和狗；猪，包括家猪（Pig)、生猪（hog)和野猪；反刍动物和/ 或有蹄类动物如牛（cattle)、公牛（oxen)、绵羊（sheep)、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和胳§它以 及马。
[0093] 在一些实施方案中，个体不是糖尿病人。在一些实施方案中，个体是糖尿病人。在 一些实施方案中，个体患有I型糖尿病、2型糖尿病，具有比正常血糖水平高的血糖水平，和 /或具有胰岛素抗性受体。
[0094] 如本文中所指出的，目前公开的个体还包括抑制细胞中OGT的方法和治疗有伤口 的个体的方法。
[0095] 在一些实施方案中，抑制细胞中OGT的方法包括对细胞施用抗OGT剂。在一些实 施方案中，细胞在个体中。在一些实施方案中，治疗有伤口的个体的方法包括对个体施用抗 OGT 剂。
[0096] 在目前公开主题的方法的一些实施方案中，抗OGT剂选自：本文中描述的具有与 OGT mRNA杂交的序列的反义OGT多核苷酸，本文中描述的抑制OGT表达的双链RNA分子，例 如siRNA，以及本文中描述的抑制OGT表达的短发夹RNA分子。
[0097] 在一些实施方案中，所述方法包括施用第二伤口愈合剂和/或第二抗OGT剂。在 一些实施方案中，如本文中描述的，将抗OGT剂提供于组合物中，用于根据目前公开的主题 的方法给药。
[0098] 在某些情况下，本文中公开的核苷酸和多肽包含在公众可用的数据库如 GENBANK?和SWISSPROT中。通过引用明确并入包括序列在内的信息以及与包括在这 种公众可用的数据库中的这类核苷酸和多肽有关的其它信息。除非另有说明或显而易见， 引用这种公众可用的数据库就是引用截至本申请申请日时数据库的最新版本。
[0099] 虽然本文中使用的术语被认为是本领域技术人员所熟知的，但为了便于说明目前 公开的主题，本文列出了定义。
[0100] 除非另有定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与目前公开的主题所 属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文中描述的类似或等同的任何方法、装 置和材料可用在目前公开主题的实践或测试中，现描述了代表的方法、装置和材料。
[0101] 根据长期存在的专利法公约，在本申请包括权利要求书中使用的术语"一个/ 一 种（a)"、"一个/ 一种（an)"和"所述/该（the)"指的是"一个/种或多个/种"。因此， 例如提及"一个细胞"包括多个这类细胞等。
[0102] 除非另有说明，本说明书和权利要求书中使用的表达成分的量的所有数字、性质 如反应条件等应理解为在所有情况下由术语"约"修饰。相应地，除非另有相反说明，本说 明书和权利要求书中列出的数字参数是可以随通过目前公开主题获得的要保护的期望性 质而变化的近似值。
[0103] 当涉及值或涉及质量、重量、体积、浓度或百分数的量时，本文所用的术语"约"指 的是包括与特定量有以下的变化，在一些实施方案中±20%、在一些实施方案中±10%、 在一些实施方案中±5%、在一些实施方案中±1%、在一些实施方案中±0.5%，以及在一 些实施方案中±0. 1%，因为这种变化适于进行所公开的方法。
[0104] 如本文中使用的，范围可以表达成从"约" 一个具体值和/或至"约"另一具体值。 还应理解的是，本文公开了大量值，且各值除其本身外，本文还公开了"约"该具体值。例如， 如果公开了值"10"，那么也公开了"约10"。还应理解的是，也公开了两个具体单位之间的 各单位。例如，如果公开了 10和15,那么也公开了 11、12、13和14。
[0105] 通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明目前公开的主题。以下实施例包括 某些显而易见的预言例。以下实施例可包括代表在与本发明相关的研发和实验过程中的不 同时间收集的数据的数据汇编。 实施例
[0106] 实施例1
[0107] 为了探讨糖尿病皮肤中细胞蛋白O-GIcNAc修饰增加是否有助于患有慢性糖尿病 皮肤溃疡的患者中观察到的伤口愈合延迟，进行了本研究。本发明人通过在提高的葡萄糖 中培养人角质细胞对高血糖症建模。在高血糖条件下，本发明人观察到（i)角质细胞蛋白 的O-GIcNAc修饰水平提高，且重要的是（ii)伤口闭合延迟。通过负责将GIcNAc部分增加 到蛋白的基因 OGT的shRNA和siRNA抑制，逆转高血糖症诱导的伤口闭合延迟。这些观察 结果表明靶向OGT有利于治疗非愈合性糖尿病伤口。
[0108] 非愈合性伤口是发病的重要源由。对于倾向于发展慢性皮肤伤口的糖尿病患者 尤其如此。丝氨酸和苏氨酸残基的0-糖基化是与蛋白磷酸化类似的常见的翻译后调控修 饰；在糖尿病和高血糖状态中已观察到胞内蛋白〇-糖基化增加。两种胞内酶即UDP-N-乙 酰氨基葡萄糖-多肽β -N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT)和Ο-GlcNAc-选择性N-乙酰 基-β-D-葡糖胺糖苷酶（OGA)分别介导来自胞内蛋白底物的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc) 的添加和除去。胞内蛋白O-GIcNAc修饰的改变与糖尿病有关联，且糖尿病组织中观察到的 蛋白〇-糖基化水平的提高可部分解释有助于伤口愈合延迟的一些所观察到的潜在病理机 理。本发明人之前己证明，通过在鼠角质细胞中超表达OGT增加蛋白0-糖基化，导致蛋白 〇-糖基化和高粘性表型增加。为了探讨糖尿病皮肤中细胞蛋白O-GlcNAc修饰的增加是否 有助于患有慢性糖尿病皮肤溃疡的患者中观察到的伤口愈合延迟，进行了本研究。在本研 究中，本发明人证明，在升高的高血糖条件下培养的人角质细胞显示出O-GIcNAc修饰水平 提高以及体外伤口闭合速率延迟。本发明人还证明，通过RNA干扰（RNAi)进行的OGT特异 性抑制显著逆转了该作用，从而为糖尿病患者的伤口愈合延迟的OGT靶向治疗干预提供了 机会。
[0109] 实验程序
[0110] 材料.细胞培养基从加洲（CA)卡尔斯巴德英杰公司（Invitrogen)获得。ShRNA 质粒从Open Biosystems (赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific),沃尔瑟 姆（Waltham)，MA)购买，并在北卡罗来纳州大学教堂山分校慢-shRNA核心设施处被包装 为失活慢病毒粒子。发夹中成熟有义链的序列是：sh0GT(TRCN0000035064;SEQ ID NO. 72 ):5' -GCCCTAAGTTTGAGTCCAAAT-3' 和 sh0GA(TRCN0000134040):5' -CCAGAAACTTTCCTTGCTA AT-3'。TRC慢病毒eGFP shRNA用作用于转导的阳性对照（Open Biosystems公司目录号 RHS4459)。小鼠单克隆O-GlcNAc特异性抗体（克隆RL2)来自Thermo Scientific公司 (Waltham，MA)。抗GAPDH 的兔单克隆抗体来自 Cell Signaling(Danvers，MA)。抗 β-肌 动蛋白的小鼠单克隆抗体来自。OGT特异性抗体来自Sigma (St. Louis, Μ0)。兔多克隆OGT 抗体来自Abeam (Cambridge, ΜΑ)。小鼠和兔抗羊辣根过氧化物酶缀合的第二抗体来自GE Healthcare (Pittsburgh, PA)。对照 siRNA (有义链：GCAGUUAUAAUGACUAGAU)和具有 3' UU 突出端（overhangs)的 OGT siRNA(有义链：GCACAAUCCUGAUAAAUUU)从 Sigma-Aldrich 购 买。
[0111] 细胞培养和划痕伤害.在正常或高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco' s modified Eagle' s medium，（DMEM)(分别 5. 5mM 或 25mM 葡萄糖）（13)、1% 胎牛血清（FBS)、1000单位盘尼西林/mL、100 μ g链霉素/mL中培养未转染的和shRNA转染 的HaCaT细胞。培养基补充有【附图说明】中指定的各种量的葡萄糖或抑制剂。使用每mL培 养基1 μ g噪呤霉素选择shRNA转染的细胞。划痕前6小时更换含噪呤霉素的培养基。进 行划痕试验前使细胞生长60小时（直至融合）。通过在24孔板中融合细胞的单层上实施 线性划痕而实施划痕伤口，接着用IXPBS洗涤一次并加入新培养基。划痕后立即使用10X 放大倍数在Nikon TE2000-U转盘式显微镜上拍摄照片，并在拍摄另一组照片之前于37°C 下培养【附图说明】中说明的时间量。接着使用Tscratch软件包分析伤口（14)。仅评价和比 较相同初始伤口大小的伤口。
[0112] 统计分析.误差线反映均值标准误差（SEM)。按具有如Tscratch软件手册中描述 的不等方差的双侧检验进行斯氏T检验。
[0113] 用shRNA稳定转导角质细胞.在DMEM，10% FBS中培养HaCaT细胞至50-60 %融 合，并利用两个感染复数（MOI)，用10 μ g/mL聚凝胺和shRNA(shGFP、shOGT或shOGA)孵育 5小时，之后将培养基换成新鲜DMEM。次日，将含1 μ g/mL嘌呤霉素的培养基加入细胞中， 以选择成功转导的细胞。在细胞培养物用于实验之前，使其在嘌呤霉素选择下传代6-8次。
[0114] 免疫印迹信号的定量。等同负载样品，并通过之前描述的SDS-PAGE分离。根据所 建实验方案进行免疫印迹，并通过增强的化学发光（ECL)反应（Amersham Biosciences公 司）显色。使用GeneSnap软件（SynGENE, Frederick, MD)对来自免疫印迹的蛋白质带定量。 对于RL2染色，使用GeneSnap软件分析三个最突出的带。
[0115] 角质细胞的SiRNA转染.用3' -UU突出端合成对抗OGT的 siRNA(3' -GCACAAUCCUGAUAAAUUU-5'）和乱序对照 siRNA(3' -GCAGUUAUAAUGACUAGAU-5'）， 并在水（工作原液，working stock)中稀释为20mM，以及根据实验方案使用脂质体 (Oligofectamine) (Invitrogen公司）转染有40%融合的角质细胞的24孔板中的各孔。简 言之，在 12 yL Opti-MEM I (Invitrogen 公司）中稀释 3 yL 脂质体（Invitrogen 公司）， 并培养8min(分钟）。同时，将3yL siRNA与50yL0pti-MEM I混合，并加入到脂质体稀 释液中，静置20min以形成复合物。然后将32yL Opti-MHM加入到混合物中，并加入（在 500 μ L高葡萄糖DMEM中的）细胞中。48小时后，将培养基换为高葡萄糖DMEM，并在60小 时时，将细胞用于划痕试验。在【附图说明】中描述的时间点拍摄照片。
[0116] 结果
[0117] 高血糖条件导致人角质细胞中的O-GIcNAc水平提高。为了研究糖尿病皮肤中 O-GIcNAc修饰水平提高是否与组织中的高葡萄糖水平有关，通过在生长培养基中补充不同 量的葡萄糖，并使人角质细胞（HaCaT)生长48小时，在细胞培养物中模拟这些条件（图1)。 细胞裂解物的免疫印迹表明，葡萄糖水平提高确实引起角质细胞裂解物中更多的O-GlcNAc 修饰，如由O-GlcNAc特异性抗体RL2所检测的（图IA和1B)。O-GlcNAc糖基化中的这种 剂量依赖性提高强调葡萄糖浓度增加与角质细胞中O-GlcNAc修饰之间的关联。
[0118] 在高血糖条件下人角质细胞表现出伤口愈合延迟.然后本发明人想测试高血糖 条件是否影响人角质细胞的伤口闭合速率。对此，本发明人使用"划痕试验"作为伤口愈合 的体外模型（图1C)。通过用不同量的葡萄糖预孵育HaCaT细胞48小时来进行分析，之后 在细胞融合层中引入"伤口"。让"伤口愈合"进行16小时表明培养基中葡萄糖水平的提高 以剂量依赖性方式降低伤口闭合速率（图1D)。
[0119] 通过RNA干涉对O-GIcNAc途径的关键酶进行的基因抑制影响人角质细胞培养物 中的伤口闭合速率。伤口闭合延迟与HaCaT细胞中O-GIcNAc修饰水平提高之间的明显关 联引导我们更详细地进一步研究负责O-GIcNAc蛋白修饰（分别为OGT和0GA)的添加或除 去的酶的作用。为了做到这一点，本发明人用对抗任一酶的shRNA稳定转导HaCaT细胞， 并通过免疫印迹分析来分析细胞裂解物（图2A和2B)。细胞裂解物的免疫印迹分析证实 了 RNAi对O-GlcNAc水平的影响，同时shOGT显示O-GlcNAc修饰水平显著降低。shOGA转 导的细胞显示出与未转导的和shGPF对照相似的O-GlcNAc修饰水平（图2B)。shRNA转 导的划痕伤害表明，抑制OGT显著提高了伤口闭合速率，而对于OGA则恰恰相反（图2C和 2D)。shGFP转导的对照与未转导的细胞无显著不同。总的来说，这些数据有力表明，降低 O-GlcNAc(shOGT)的量加速伤口愈合，而抑制O-GlcNAc(shOGA)的除去则抑制人角质细胞 的伤口愈合，因此强调了 O-GlcNAc水平和伤口愈合速率之间的关联。
[0120] OGT的siRNA抑制减少角质细胞O-GIcNAc糖基化，并在高血糖条件下加速伤口闭 合。为了研究使用治疗上更相关的方法靶向OGT基因表达的潜力，本发明人测试了作为抑 制OGT的手段的小干扰RNA(siRNA)(图3)。合成针对OGT mRNA序列的19mer (单元单体） siRNA，并使用具有乱序序列的siRNA转染HaCaT细胞，作为对照。转染2天后，探测细胞裂 解物的RL2和OGT免疫反应性（图3A和3B)。结果表明对抗OGT的siRNA引起OGT水平和 RL2免疫反应性的明显抑制，这可由免疫印迹定量。
[0121] 接着，在划痕伤害分析中测试siRNA转染的细胞，以检查这种形式的OGT RNAi对 体外伤口闭合的影响。图3C示出26小时时间点时，与对照siRNA和未处理细胞相比，用 OGT siRNA的伤口愈合进展显著更多（图3D)。这些结果进一步支持人角质细胞中的胞内 O-GlcNAc修饰水平与伤口闭合速率有关，并且这可使用OGT抑制来进行操作。
[0122] OGT的shRNA抑制减少了角质细胞胞内蛋白0-糖基化；而OGA抑制增加了蛋白 〇-糖基化.使靶向GFP (对照）、OGT和OGA的shRNA稳定转染的HaCaT细胞生长至融合。然 后用抗（i)O-GlcNAc修饰（RL2)、（ii)OGT蛋白和（iii)GAPDH(负载对照）的抗体通过免疫 印迹来分析细胞裂解物，如图8A和图8B中所示。如所示，OGT的基因抑制减少了 O-GlcNAc 蛋白修饰；而OGA的基因抑制则增加了 O-GlcNAc蛋白修饰。
[0123] 当通常施