。待溶解后再缓慢地加入12.0 mL (174.4 mmol)新蒸馏的吡咯，然后再加入0.03 mL的三氟乙酸作催化剂，室温搅拌1小时。反应停止后，将粗产物用饱和碳酸钠溶液洗涤一次，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得到1.42 g的灰白色固体III，产率为46%ο 核磁氢谱:? NMR (400 MHz，CDC13) δ ppm:7.34 (d, /= 2.27 Hz, 1H)，6.99 (d,/= 8.32 Hz, 1H), 6.76 (m, 2H)，6.19 (dd, /=5.93，3.03 Hz, 3H), 6.05 (m, 2H),
5.62 (s, 1H), 5.45 (s, 1H)，4.12 (dd, /= 14.48, 7.30 Hz, 1H)，2.05 (s, 1H)。
[0027]实施例3、
取0.71g (2.06 mmol)化合物III加入150 mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50 mL干燥的二氯甲烷，然后加入0.51 g (2.24 mmol)DDQ，室温下搅拌反应1.5 h。再加入2.9 mL(20.61 mmol)三乙胺，最后缓慢加入3.9 mL (30.86 mmol)三氟化硼乙醚，室温下搅拌反应22 ho反应结束后，将以上粗产物用50 mL蒸馏水水洗三次，然后用二氯甲烷萃取，硅胶柱纯化，得到橘红色固体化合物物IV 0.3 g，产率约为42%。核磁氢谱:? NMR (400 MHz,CDC13) δ ppm: 7.98 (s, 2H), 7.69 (m, 5H), 7.55 (d, /= 2.41 Hz, 1H), 7.17 (d, J=8.67 Hz, 1H), 6.96 (d, /= 4.33 Hz, 2H), 6.57 (d, /= 3.69 Hz, 2H), 5.43 (s, 1H)。
[0028]实施例4、
取0.10 g(0.26 mmol)化合物IV加入到100 mL的三口烧瓶中氮气保护，加入0.04 mL(0.31 mmol)干燥的三乙胺和10mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降温，加入0.026 mL(约0.31 mmol)丙烯酰氯。冰浴下搅拌反应4小时。反应停止后，加入少量水淬灭。将以上粗产物经过水洗、萃取、干燥、硅胶柱纯化后。得到纯的0.04克橘红色化合物，产率约为35%。核磁氢谱:? NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 7.93 (s, 2H)，7.87 (dd, /=8.50,
2.55 Hz, 1H), 7.77 (dd, /= 17.24，10.54 Hz, 2H)，7.71 (m, 3H)，7.49 (m, 1H)，
6.86 (d, /= 4.28 Hz, 2H)，6.52 (d, /= 3.12 Hz, 2H), 6.33 (dd, /= 17.27，1.11Hz, 1H), 6.06 (d, /= 17.2 Hz, 1H)，5.89 (dd, /= 10.53，1.03 Hz, 1H)。
[0029]实施例5、荧光实验
取实施例1制备的荧光探针化合物，溶解到含有50%乙腈的水溶液中，用HEPES缓冲溶液调节pH = 7.4 ;得荧光探针溶液，备用。
[0030]1、取荧光探针溶液，分23组，每组10毫升，其中1组不加氨基酸，22组分别加入含有 Cys, Hey, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met,Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val，使得每组溶液中含有探针化合物的浓度为5 μ Μ,氨基酸浓度为300 μΜ，使得氨基酸与探针化合物的摩尔比为60:1 ;采用激发波长为360nm，荧光光度计测试其荧光强度，如图5所示，结果显示:本发明探针溶液本身具有很强的荧光，发射波长为525 nm, 一旦加入半胱氨酸，其荧光迅速淬灭，加入高半胱氨酸和谷胱甘肽荧光少许淬灭，而其他氨基酸加入后溶液的荧光没有变化，对半胱氨酸具有很高的选择性。
[0031]2、取荧光探针溶液，分13组，每组10毫升，分别加入不同浓度的半胱氨酸溶液，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为5 μ M，半胱氨酸的浓度分别为探针化合物浓度的0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60倍。采用激发波长为360 nm，荧光光度计测试其荧光强度，如图6所示，结果显示:溶液在525 nm处荧光迅速淬灭，其荧光强度与浓度成线性关系。根据测试计算，本探针化合物的最低检测限为3.7 X ΙΟ'8 mol/Lo
[0032]实施例6、细胞成像实验:将HUVEC细胞在37°C条件下于含有20微摩尔每升的本发明探针I的细胞培养基中培养30分钟，探针分子迅速的进入细胞内并显示出强荧光，然后用1.2毫摩尔每升的半胱氨酸处理3.5小时，其强荧光迅速淬灭(如图8)。
【主权项】
1.一种半胱氨酸荧光探针化合物，具有式I所示的结构(如图1)。2.一种权利要求1所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤: 本发明所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤: (1)将4-氰基联苯酚和无水氯化镁混合溶于乙腈中，再加入适量的三乙胺和多聚甲醛，反应加热回流五小时，得到化合物II (如图2); (2)将上步制得化合物II溶于二氯甲烷中，缓慢加入吡咯和少量三氟乙酸催化，室温反应搅拌一小时，得到化合物III(如图3); (3)将上步制得的化合物III溶于二氯甲烷中，加入适量DDQ并在室温下搅拌1.5小时，之后再加入三乙胺和三氟化硼-乙醚溶液，并在室温下搅拌反应22小时，得到化合物IV(如图4)； (4)将上步制得的中间产物IV溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和丙烯酰氯，在冰浴下反应4小时，得到探针分子化合物I。3.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)所述氰基联苯酚、无水氯化镁、三乙胺和多聚甲醛的摩尔比为1:1.5:4:15。4.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所述化合物I1、三氟乙酸和吡咯的摩尔比为1:0.1:20ο5.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)所述化合物II1、DDQ、三乙胺和三氟化硼-乙醚的摩尔比为1:1.2:10:15。6.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤(4)所述化合物IV、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1:1.2:1.2； 如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤(1)- (4)全程在氮气保护下进行，且步骤(1)反应回流温度为81°C。7.如权利要求2所述的半胱氨酸荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，步骤如下: (a)取6.24 g (32mmol)的氰基联苯酸和4.56 g (48 mmol)的无水MgCl2于三口烧瓶中，氮气保护，再加入16.3 mL (122 mmol)三乙胺，然后加入了 80 mL无水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32 g (440 mmol)，加热回流8小时；反应完成后，冷却至室温，然后用少量水进行淬灭，再加入大量的6 Μ盐酸进行酸化，二氯甲烷萃取，硅胶柱分离，得到白色固体化合物II 3.51 g，产率约为50% ； (b)取2.00 g (8.96 mmol)产物II加入150 mL的三口烧瓶中，氮气保护，加入50 mL干燥的二氯甲烷，室温下搅拌； 待溶解后再缓慢地加入12.0 mL (174.4 mmol)新蒸馏的吡咯，然后再加入0.03 mL的三氟乙酸作催化剂，室温搅拌1小时；反应停止后，将粗产物用饱和的碳酸钠溶液洗涤一次，二氯甲烷萃，硅胶柱分离，得到1.42 g的灰白色固体产物III，产率为46%; (c)取0.71g(2.06mmol)产物III加入150 ml的三口烧瓶中，氮气保护，加入50 ml干燥的二氯甲烷，然后加入0.51 g (2.24 mmol) DDQ，室温下搅拌反应1.5 h，再加入2.9 mL(20.61 mmol)三乙胺，最后缓慢加入3.9 mL (30.86 mmol)三氟化硼乙醚，室温下搅拌反应22 h;反应结束后，将以上粗产物用50 mL蒸馏水水洗三次，然后加入二氯甲烷萃取，硅胶柱纯化，得到橘红色固体化合物IV 0.3 g，产率约为42% ； (d)取0.10g (0.26 mmol)中间产物IV加入100 mL的三口烧瓶中氮气保护，加入0.04 mL (0.31 mmol)干燥的三乙胺和10 mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降温，加入0.026 mL (约0.31 mmol)丙烯酰氯，冰浴下搅拌反应4小时，反应停止后，加入少量水淬灭。8.将以上粗产物经过水洗、萃取、干燥、硅胶柱纯化后，得到0.04克橘红色化合物，产率约为35%。9.权利要求1所述的半胱氨酸荧光探针化合物的应用，可以用于检测水体中的半胱氨酸含量以及细胞成像研究。
【专利摘要】本发明涉及一种半胱氨酸荧光探针化合物及其制备与应用，所述半胱氨酸荧光探针化合物具有式I的结构。制备方法是：将4-氰基联萘酚与多聚甲醛反应，得到的产物II与吡咯反应得到中间产物III，之后DDQ氧化脱氢、与三氟化硼-乙醚螯合，丙烯酰氯羟基氢而得。该探针化合物对半胱氨酸具有很好的选择性和灵敏性，且对细胞没有毒性，可以应用于细胞内的检测和成像。
【IPC分类】C07F5/02, C12Q1/02, C09K11/06, G01N21/64
【公开号】CN105418662
【申请号】CN201510664252
【发明人】吕正亮, 黄曦明, 范春华
【申请人】济南大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年10月14日