4]各收集8例正常椎间盘髓核组织和椎间盘退行性疾病髓核组织样本，上述所有标 本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0065] 2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作）
[0066] 1)组织提取
[0067] 在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体椎间盘髓核组织样 本，用杵棒研磨至粉末状，然后将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中。加入300μ1 裂解液，置于勾衆器内，充分研磨5min，12000g，4°C，离心10min，转移上清至新的1.5ml的离 心管中。加入600μ1不含RNA酶的水，用漩涡器混匀后，加入20μ1蛋白酶K，在55°C温浴15min， 不断涡旋混匀。14000g，室温离心lmin，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外 一个不含RNA酶的1.5ml离心管中，加入450μ1的95%乙醇，涡旋混匀。
[0068] 2)RNA 吸附：
[0069] 取650μ1含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心lmin，弃下层，将柱子重新置 于收集管中；重复操作一次，然后加入400μ1清洗液，14000g离心2min，弃下层，将柱子置于 一新的收集管上。
[0070] 3)DNase 处理：
[0071] 加入100μΙ Enzyme Incubation Buffer和15μ1 DNase I，14000g离心lmin，将收 集管中的溶液重新移入柱中，室温放置15min。
[0072] 4)RNA 洗涤：
[0073]加入400μ1清洗液，14000g离心lmin，弃下层，将柱子重置于收集管中，然后加入 400μ1清洗液，14000g离心2min，弃收集管。
[0074] 5)RNA 洗脱：
[0075] 把柱子放入1.5ml Elution管中，加入30μ1洗脱液，200g离心2min，使溶液充分与 柱子结合，然后14000g离心lmin。
[0076] 3、高通量转录组测序
[0077] l)RNA_seq 读段定位
[0078] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat vl. 3.1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组(hgl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认 到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的 剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用 TopHat方法的系统默认参数。
[0079] 2)转录丰度评估
[0080]匹配上的读段文件通过Cufflinks vl.0.3处理，Cufflinks vl.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因 lkb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_ sapiens.GRCh37·63·gtf)〇
[0081] 3)差异表达基因的检测
[0082] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在Cuff idff输出中只有q值<0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0083] 4、结果
[0084] RNA-seq结果显示，NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病组织中的表达量显著高于正 常的椎间盘髓核组织。
[0085] 实施例2QPCR测序验证NDUFAB1基因的差异表达
[0086] 1、根据高通量测序的检测结果选择NDUFAB1基因进行大样本QPCR验证。按照实施 例1中的样本收集方式选择椎间盘退行性疾病髓核组织和正常椎间盘髓核组织各60例。 [0087] 2、RNA提取步骤同实施例1。
[0088] 3、逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0089] (1)取总RNA lyg进行逆转录，加入01igo(dT)2yl，充分混匀。70°C水浴5min后立即 冰浴2min。
[0090] (2)构建25μ1反应体系，其中包括5X逆转录缓冲液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，补无核酸酶水至预期体积。
[0091] (3)42°C 水浴 60min 后，95°C 水浴 5min 以灭活 M-MLV。
[0092] (4)_20°C 储存备用。
[0093] 4、QPCR 扩增
[0094] (1)引物设计
[0095] 根据Genebank中NDUFAB1基因和GATOH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0096] NDUFAB1 基因：
[0097] 正向引物为5'-ACTCTATGACAAGATTGAC-3'（SEQ ID N0.3);
[0098] 反向引物为5'-CAGCATCTATATCAGGAAT-3'（SEQ ID N0.4)。
[0099] GATOH基因：
[0100] 正向引物为5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0101] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0102] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0103] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0104] 表1 PCR反应体系
[0105]
[0106] (3)PCR反应条件：95°ClOmin，（95°C30s，60°C40s) X 40个循环。以SYBR Green作为 荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，△△ CT法进行相对定量。
[0107] 5、统计学方法
[0108] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具 有统计学意义。
[0109] 6、结果
[0110] 结果如图1所示，与正常椎间盘髓核组织相比，NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病 髓核组织中的表达上调，差异具有统计学意义(P〈〇.〇5)，同RNA-sep结果一致。
[0111] 实施例3抑制NDUFAB1基因表达
[0112] 1、细胞培养:将获取的髓核组织在无菌条件下用D-HANKS液冲洗3次，然后用剪刀 将髓核组织剪碎（约1mm 3大小），置于无菌离心管中；使用0.25%胰蛋白酶于37°C消化 20min，每5min摇动一次，800rpm离心5min，弃去上清液;使用0.2% Π 型胶原酶37°C消化4h， 用200目筛网过滤;然后滤液以800rpm离心5min，弃去上清液;DMEM/F12培养基冲洗，800rpm 离心5min，重复3次;细胞计数后接种于培养瓶，含15 %胎牛血清及1 % P/S的DMEM/F12培养 基作为培养液，于37°C，5 % C02的培养箱中培养。
[0113] 2、siRNA 设计
[0114] 针对 NDUFAB1 的 siRNA 序列：
[0115] siRNAl-NDUFABl：
[0116] 正义链为5'-UUCAAUACGUAAAGAACACGG-3'（SEQ ID N0.7);
[0117] 反义链为5'-GUGUUCUUUACGUAUUGAAAC-3'（SEQ ID N0.8)，
[0118] siRNA2-NDUFABl：
[0119] 正义链为5'-UGUCAUAGAGUUUCAAUACGU-3'（SEQ ID N0.9);
[0120] 反义链为5'-GUAUUGAAACUCUAUGACAAG-3'（SEQ ID N0.10)，
[0121] siRNA3-NDUFABl：
[0122] 正义链为5'-AGAAUUUACUGAAAGCUUCUC-3'（SEQ ID N0.11);
[0123] 反义