链为5'-GAAGCUUUCAGUAAAUUCUCA-3'（SEQ ID N0.12)
[0124] 阴性对照siRNA序列（siRNA-NC):
[0125] 正义链为5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'（SEQ ID N0.13);
[0126] 反义链为5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'（SEQ ID N0.14)。
[0127] 将细胞按1 X 104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%C02培养箱中细胞培养 2 4 h，在无双抗、含10 % F B S的D Μ E Μ培养基中，转染按照脂质体转染试剂2 0 0 0 (购自于 Invi trogen公司）的说明书转染，实验分为阴性对照组（siRNA-NC)和实验组（20ηΜ) (siRNAl-NDUFABl、siRNA2-NDUFABl、siRNA3-NDUFABl )，其中阴性对照组 siRNA 与 NDUFAB1 基 因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
[0128] 3、QPCR检测NDUFAB1基因的转录水平
[0129] 3.1细胞总RNA的提取
[0130] 米用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No. 15596-018)总RNA提取试剂，按说明书 提供方法提取髓核细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次，加入 适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以lml/管分装至1.5ml Eppendorf?管 中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4°C、12000rpm离心15min，将上层 水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混勾，室温放置lOmin，4°C、7500r/ min离心10min。弃上清，75 %乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm离心5min，室温干燥RNA沉淀，5-lOmin后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用 Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
[0131] 3.2逆转录步骤同实施例2。
[0132] 3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
[0133] 4、统计学方法
[0134] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰NDUFAB1基因表达组与对照组之间的差异 采用t检验，认为当P〈0.05时具有统计学意义。
[0135] 5、结果
[0136] 结果如图 2 显示，相比 s i RNA2-NDUFAB1、s i RNA3 -NDUFAB1，s i RNA 1-NDUFAB1 能够更 有效抑制NDUFAB1基因的表达，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0137] 实施例4NDUFAB1基因对椎间盘退行性疾病细胞增殖的影响
[0138] 采用MTT实验检测NDUFAB1基因对椎间盘退行性疾病细胞增殖能力影响。
[0139] 1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
[0140] 2、步骤:各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种 于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测： 每孔加入5g/L的MTT液20μ1，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMS0 150μ1，细心吹打，使紫 蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(Α值）。然后每12h检测1次，连续测 72h，共7次。本实验重复3次。
[0141] 3、统计学方法
[0142] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之 间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统计学意义。
[0143] 4、结果
[0144] 图3所示的结果显示：siRNAl-NDUFABl组的细胞生长速度明显高于转染siRNA-NC 组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。上述结果表明NDUFAB1表达不利于椎间 盘髓核细胞的生长，通过抑制NDUFAB1基因的表达可以促进椎间盘退行性疾病细胞的生长。
[0145] 实施例5NDUFAB1基因对椎间盘退行性疾病细胞凋亡的影响
[0146] 使用流式细胞仪检测NDUFAB1基因对细胞凋亡的影响。
[0147] 1、细胞培养步骤同实施例3。
[0148] 2、细胞转染步骤同实施例3。
[0149] 3、步骤
[0150] 细胞转染72h后，使用预冷roS洗涤细胞，然后用0.25 %胰酶消化细胞，中止消化， 将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为IX 106个/ml，取200μ1上述细胞悬液放置到 Eppendorf管中，加入10μ1 Annexin-V-FITC混勾，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加 入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μ1。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于 标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
[0151] 3、统计学方法
[0152] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P〈0.05时 具有统计学意义。
[0153] 4、结果：
[0154] 转染siRNAl-NDUFABl组的细胞凋亡率为(9.95±0.18)%，转染siRNA-NC组的细胞 凋亡率为(33.23±0.88)%，上述差异具有统计学意义(P〈0.05)，上述结果表明，NDUFAB1表 达有促进椎间盘髓核细胞的凋亡，通过抑制NDUFAB1基因的表达可以减少椎间盘髓核细胞 的凋亡。
[0155] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基因及其表达产物在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用，其特征在 于，所述基因为NDUFAB1。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交或芯片检测NDUFAB1基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行 性疾病的产品。3. -种诊断椎间盘退行性疾病的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测椎间盘组 织中NDUFAB1基因的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。4. 根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核 苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测NDUFAB1基因转录水平的针对NDUFAB1基因的寡 核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的NDUFAB1蛋白的特异性 抗体;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括 用于检测NDUFAB1基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括NDUFAB1蛋白的特异 性抗体。5. 根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括针对NDUFAB1基因的引物和/ 或探针。 6. NDUFAB1基因及其表达产物在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物包含NDUFAB1基因和/或其表达 产物的抑制剂。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对NDUFAB1的siRNA。9. 一种用于治疗椎间盘退行性疾病的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求7或8 所述的抑制剂。10. 权利要求7或8所述的抑制剂在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种与椎间盘退行性疾病相关的分子标记物，更具体地涉及NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病诊断和治疗中的应用。本发明还公开了NDUFAB1基因在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用，同时公开了NDUFAB1基因在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。
【IPC分类】A61K48/00, C12Q1/68, G01N33/68, A61P19/08, A61K45/00
【公开号】CN105483242
【申请号】CN201510993137
【发明人】叶伟亮
【申请人】叶伟亮
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月24日