和2.45mM的过硫酸钾等体积混合，于暗处 室温反应16h，用pH7.2的磷酸缓冲液稀释50倍，至吸光度值0.7左右(734nm)。再吸取此稀释 液100yL加入含100yL不同浓度的样品，室温反应5min，734nm测定吸光度值。
[0088] 清除率 ％ = 1-(A1_A2)/A0
[0089] A1:样品+ABTS的吸光度值;A2:样品+溶剂的吸光度值;A0: ABTS的吸光度值 [0090]结果如图10显示，本发明黄酮类化合物具有清除ABTS自由基的能力，且具有剂量 依赖关系，在浓度250yg/mL时，对ABTS自由基的清除率与Vc相当，达到100%。通过计算得， 本发明黄酮类化合物清除ABTS的IC 5Q值分别为4.64yg/mL。
[0091] 4)还原能力测定：25yL样品加入50yL 0.2M PH6.0PBS和25yL的1%铁氰化钾，于45 °C反应30min。再加入40yL 10%三氯乙酸和60yL 0.1%三氯化铁，700nm处测定吸光度值。
[0092] 结果如图11显示，本发明黄酮类化合物具有一定的还原能力，且具有剂量依赖关 系。
[0093] 2、抗肿瘤活性和免疫增强活性
[0094]以促RAW264.7巨噬细胞增殖、吞噬及产N0,抗HGC-27肿瘤细胞增殖，以及小鼠体内 抑瘤试验为试验平台，评价本发明黄酮类化合物的抗肿瘤活性和免疫增强活性。
[0095] (1)对巨噬细胞产N0的影响
[0096] RAW264.7 细胞培养：
[0097] RAW 264.7细胞以10%胎牛血清的1^11-1640培养液培养于37°〇5%〇)2饱和湿度 空气的细胞培养箱中，每隔Id传代一次。传代时，用0.25%胰蛋白酶液消化贴壁的细胞60s 左右，倾倒出酶液，加入新鲜的含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培养液，并用吸管吹吸数次， 以1:4比例传代培养。
[0098] N0的诱生：
[0099] 按1 X 106个/孔将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞加入24孔板中。培养过夜后，将 样品按实验设计，加入24孔培养板，并以PBS补足至终体积为ΙΟΟΟμΜ每种浓度设3个平行 孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10,20，100,200yg/mL。同时，做阳性对照孔(加入终浓度 为10yg/mL的LPS)。在37°C5%C0 2饱和湿度空气条件下培养2d。培养结束后，分别吸取培养 上清液，立即进行NO检测。
[0100] NO 检测：
[0101 ] 采用Griess法测定体系中N0的含量。N0不稳定，Griess法是测定由N0分解而成的 Ν0-2/Ν0-3的比例来反应其含量。
[0102] 标准曲线的绘制：
[0103] 准确称取NaN026.9g，以ddH20定容至100mL，并进一步梯度稀释为浓度为100μΜ的工 作液。利用ddH2〇将工作液稀释至终浓度50μΜ，40μΜ，30μΜ，20μΜ，1 ΟμΜ，5μΜ，2μΜ，ΟμΜ。于每孔 中加入等体积混合后的Griess试剂Α液和Β液100yL。室温反应20min后，于酶标仪上测定 540nm处吸光度。以标准品浓度和吸光度值为横纵坐标，绘制标准曲线。
[0104]样品检测：
[0105] 在酶标板中准确加入样品作用后的培养上清液100yL。于每孔中加入等体积混合 后的Griess试剂A液和B液100yL。室温反应20min后，于酶标仪上测定540nm处吸光度。利用 标准曲线方程求出上清液中N0的浓度。
[0106] 以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图12)，推导出标准曲线 方程为Y = 0.0068X+0.0428(R2 = 0.9985)。将样品各浓度的吸光度数据带入标准曲线方程， 求得样品各浓度细胞液上清中Ν0的浓度。
[0107] 实验结果如图13显示，RAW264.7巨噬细胞自身产生的N0量较少，但在受到LPS刺激 后，N0大量产生(？〈0.01)。本发明黄酮类化合物在10(^8/11^能够促进巨噬细胞产生^)(?〈 0.01)。
[0108] (2)对巨噬细胞吞噬能力的影响
[0109]按1 X 105个/孔将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞加入96孔板中。培养过夜后，将 三个化合物按实验设计，加入96孔板中，并以ros补足至终体积为200yL;每种浓度设3个平 行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200yg/mL。同时，做阳性对照孔(加入终浓 度为 l〇yg/mL 的 LPS)。
[0110] 细胞在37°C5 %⑶2饱和湿度空气条件下培养24h。培养结束后，轻轻吸去上清液， 加入lmg/mL中性红溶液100yL。30min后，吸去中性红染液，并以37°C的PBS洗板数次，直至细 胞外染料全部洗净。离心并小心吸去后，加入细胞裂解液（乙醇：乙酸= 24:1) 100yL，4°C 放置lh，至细胞全部裂解。震荡混匀后，在酶标仪上测定波长540nm处0D值。
[0111] 吞噬作用是巨噬细胞行使其功能的一个重要方式。通过检测巨噬细胞内的中性红 染料，可以反应巨噬细胞的吞噬能力。实验结果如图14表明，本发明黄酮类化合物能促进巨 噬细胞的吞噬功能(P〈〇. 05)。
[0112] (3)对巨噬细胞增殖的影响
[0113] 将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞按2X104个/孔浓度加入96孔板中。培养过夜 后，将样品按实验设计，加入96孔培养板，并以含PBS补足至终体积为200yL;每种浓度设3个 平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200yg/mL。同时做空白对照孔（只加细胞 培养液)。
[0114] 细胞加样后在37°C5 %⑶2饱和湿度空气条件下培养48h，倒置显微镜下观察细胞 生长状况。于培养结束前4h，弃上清。每孔加入100yL的PBS，然后加入5yL浓度为5mg/mL的 MTT继续培养，培养结束后，每孔加10 % SDS (用0.01M的HC1配制）100yL，37°C下放置过夜。振 荡混匀，使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔0D值。
[0115] 通过实验如图15发现，本发明黄酮类化合物对单核巨噬细胞株RAW264.7都有明显 的促进或抑制增殖的作用(P〈〇. 05)，说明其对巨噬细胞的增殖有显著影响。
[0116] (4)抗HGC-27细胞增殖的测定 [0117]细胞培养：
[0118] HGC-27细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养于37°C5%⑶2饱和湿度空气的 细胞培养箱中，每隔Id传代一次。传代时，用0.25%胰蛋白酶液消化贴壁的细胞30s左右，倾 倒出酶液，加入新鲜的含有10 %胎牛血清的DMEM培养液，并用吸管吹吸数次，以1:4比例传 代培养。
[0119] 细胞增殖实验：
[0120]将对数生长期的HGC-27巨噬细胞按3000个/孔浓度加入96孔板中。于37°C培养箱 中孵育过夜，将样品按实验设计，加入96孔培养板，并以含10 %胎牛血清的无酚红DMEM培养 液补足至终体积为2〇〇yL;每种浓度设3个平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20， 100，200yg/mL。同时做空白对照孔（只加细胞培养液）。
[0121]细胞加样后在37°C5 %⑶2饱和湿度空气条件下培养48h，倒置显微镜下观察细胞 生长状况。于培养结束前4h，弃上清，每孔加入100yL PBS，然后加入度为5mg/mL的MTT 继续培养，培养结束后，每孔加10 % SDS (用0.01M的HC1配制）100yL，37°C下放置过夜。振荡 混匀，使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔0D值。
[0122]结果如图16所示，本发明黄酮类化合物对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用都较 强，具有抗肿瘤作用。
[0123] (5)小鼠体内抑瘤试验
[0124] 取腹腔接种S1807d后的荷瘤小鼠，以注射器在无菌条件下抽取腹水，腹水应为乳 白至淡黄色，无血色。以无菌生理盐水稀释至4 X 107个/ml，置于冰水浴中备用。
[0125] KM小鼠（18_22g)购回后，在每只小鼠右侧腋窝皮下准确接种瘤液0.2ml，饲养过夜 后，分组。接种次日，小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。其中空白组每日腹腔注射生理 盐水0. lml/10g，给药组腹腔注射本发明黄酮类化合物0. lml/10g(2mg/10g)，连续给药7天。 末次给药4h后，颈椎脱白处死小鼠，分离腋下肿瘤并立即称瘤重。
[0126] 结果如表2所示，本发明黄酮类化合物对于S180肿瘤细胞的体内抑瘤率为67.2%， 具有抗肿瘤的作用。
[0127] 表2 KM小鼠体内抑瘤试验
[0128]
[0129] 3、PCI 2细胞保护作用
[0130] (1)细胞活力测定(MTT比色法）
[0131] 细胞存活率用细胞增殖抑制实验(MTT比色法)测定。取对数生长期的PC12细胞，按 40000个/孔加入96孔板中，37°C5%⑶ 2培养箱中孵育过夜。将受试样品按实验设计加入96 孔板中，并以培养基补足至终体积200yL;每个浓度设置3个平行孔，共5个浓度梯度，终浓度 分别为〇，1，1〇,20，100,20(^/111匕加入受试样品后，与细胞共同孵育611，然后加入终浓度 200μΜ的H 2〇2进行细胞损伤，同时做不加受试样品和H2〇2的对照孔，以及只加 H2〇2的模型组。 将细胞板置于37°C5%⑶2培养箱中继续孵育18h，弃去上清液，加入100yL的缓冲液和5yL 5mg/mL的MTT，继续培养4h后，每孔加入100yL SDS，过夜培养。于570nm处测定吸光度值。吸 光度值与细胞存活率具有正相关性，因此，吸光度值能反应PC12细胞的存活率。各组细胞存 活率通过下列公式进行计算。
[0132] 细胞活力（％ )=实验组吸光度值/对照组吸光度值X 100
[0133] 从图17可以看出，与对照组(规定对照组细胞活力为100%)相比，模型组细胞活力 显著降低(？〈0.05)，细胞活力