52%，表明？(：12细胞对20(^的!1 202非常敏感，造模成功。与模 型组相比，本发明黄酮类化合物浓度lOOyg/mL~200yg/mL范围内，具有显著差异性（P〈 〇. 05)，说明其能减轻H2〇2对PC12细胞的损伤，作用具有剂量依赖性。200yg/mL时，本发明黄 酮类化合物的PC12细胞存活率为为81.21 %。
[0134] (2)细胞内MDA、LDH含量，以及SOD、CAT、GSH-Px酶活力的测定
[0135] 样品准备：
[0136] 取对数生长期的PC12细胞，按5.0 X 105/孔加入24孔板中，37°C5 %C02培养箱中孵 育过夜。加入l〇〇yg/mL的样品后，与细胞共同孵育6h，然后加入终浓度200μΜ的H 2〇2进行细胞 损伤，同时做不加样品和H2〇2的对照孔，以及只加 H2〇2的模型组。将细胞板置于37°C5%C02培 养箱中继续孵育18h，收集上清液用于LDH含量测定，细胞沉淀中加入100yL l%Triton溶 液，将细胞板置于_80°C条件下，裂解细胞lh，即得检测样品，用于丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶 (LDH)、超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、过氧化氢酶(CAT)含量的测 定。
[0137] MDA、LDH、SOD、GSH-px、CAT 的含量测定：
[0138] 参考试剂盒说明书对样品进行MDA、LDH含量，以及SOD、GSH-Px、CAT1酶活进行测定。
[0139] 结果如图18所示，与对照组相比（规定对照组MDA水平为100% )，模型组中MDA含量 明显升高(P〈〇.05);而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中MDA的含量明显降低(P 〈0.05)，说明其能够降低PC12细胞中由H2〇2损伤引起的MDA含量升高。
[0140] 样品对LDH释放量的影响如图19所示，与对照组相比（规定对照组LDH释放量为 1 〇〇 % )，模型组中LDH含量明显升高(P〈0.01);而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药 组中LDH的含量明显降低(P〈0.05)。结果表明本发明黄酮类化合物能减少PC12细胞的LDH释 放量。
[0141] 结果如图20所示，与对照组相比（规定对照组S0D酶活力为100%)，模型组中S0D酶 含量明显降低(P〈〇.05);而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中S0D的活性明显升 高(Ρ〈0·05)，说明其能提高PC12细胞内S0D的活力。
[0142] 样品对CAI1酶活力影响图21所示，与对照组相比（规定对照组CAT酶活力为100% )， 模型组中CAT酶含量明显降低(P〈0.01);而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中 CAI1酶的活性明显升高(P〈0.01)。说明其能提高PC12细胞内CAI1酶的活力。
[0143] 本发明黄酮类化合物对GSH-Px酶活力影响如图22所示，与对照组相比（规定对照 组GSH-Px酶活力为100 % )，模型组中GSH-Px酶含量明显降低(P〈0.01);而与模型组相比，本 发明黄酮类化合物给药组中GSH-Px酶的活性明显升高(P〈0.05)。说明其能提高PC12细胞内 GSH-Px的活力。
[0144] (3)细胞内活性氧(R0S)的测定
[0145] 取对数生长期的PC12细胞，按1.0 X 106/孔加入6孔板中，37°C孵育过夜。随机分 组：正常组、300μΜ H2〇2组、300μΜ H2〇2+样品组。用100yg/mL的样品预处理细胞24h，后加入 300μΜ H2〇2诱导3小时。细胞内活性氧检测按照活性氧试剂盒进行。悬浮PC12细胞，用浓度10 μΜ的活性氧荧光探针，在避光条件下反应，对细胞进行染色，37°C孵育30分钟后，3000转/ 分，离心5分钟，弃上清。利用PBS液洗涤细胞3次，把细胞外残留的荧光试剂洗干净，去掉背 景荧光的干扰。在多功能酶标仪上，使用激发波长488nm，发射波长525nm，测定细胞R0S的荧 光强度，胞内R0S含量与荧光强度成正比，可通过测得的荧光值反应细胞内R0S的含量。
[0146] 样品对细胞内R0S含量的影响如图23所示，与对照组相比，模型组中R0S含量明显 升高（规定模型组中R0S含量为100% )(P〈0.01);而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给 药组中R0S含量明显降低(P〈0.05)，说明其能抑制由H 2〇2损伤引起的细胞内R0S含量升高。
[0147] (4)PC12细胞线粒体膜电位的测定
[0148] JC-1染料染色细胞后，线粒体膜电位完全丧失，染色后呈绿色荧光。正常细胞呈红 色荧光。
[0149] 取对数对数生长期的PC12细胞，按5X 105/孔加入24孔板中，37°C孵育过夜。随机 分组:正常组、300μΜ H2〇2组、300μΜ H2〇2+样品组。100yg/mL的样品与细胞共同孵育6h，然后 加入终浓度300μΜ的H2〇 2进行细胞损伤。将细胞板置于37°C5 % C02培养箱中继续孵育18h，在 培养结束时，离心收集细胞，用〇. 5ml细胞培养液重新悬浮细胞，然后加入5yg/mL的JC-1染 料，于37°C中反应20min，用PBS洗涤细胞3次。利用倒置荧光显微镜观察荧光。
[0150] 结果如图24显示，正常组中多数细胞呈红黄色荧光。而H202模型组细胞几乎呈绿色 荧光，只有少数细胞依稀可见黄色荧光，表明细胞线粒体膜电位下降甚至丧失。与模型组相 比，本发明黄酮类化合物能使细胞中红黄色荧光比例增加，表明其能够稳定线粒体膜电位。
【主权项】
1. 黄酮类化合物，命名为6，8，4 C三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4 c〇-(4~-吡喃葡 萄糖基)吡喃葡萄糖苷，其分子式为C33H4〇02()，其结构式如式1:2. 权利要求1所述的黄酮类化合物在用于制备具有抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫增强 活性或PC12细胞保护作用中任意一项所述活性的药物或保健食品中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述具有抗氧化活性是指具有清除DPPH自由基的能力； 所述具有抗氧化活性是指清除羟自由基的能力； 所述具有抗氧化活性是指具有清除ABTS自由基的能力； 所述具有抗氧化活性是指具有还原能力。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述抗肿瘤活性是指对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用。5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述具有免疫增强活性是指能够促进巨噬细胞产生NO; 所述具有免疫增强活性是指能促进巨噬细胞的吞噬功能； 所述具有免疫增强活性是指对巨噬细胞的增殖有显著影响。6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:满足以下任意一项： 所述具有PC12细胞保护作用是指能减轻H2O2对PC12细胞的损伤； 所述具有PC12细胞保护作用是指能够降低PC12细胞中由H2O2损伤引起的MDA含量升高； 所述具有PC 12细胞保护作用是指减少PC 12细胞的LDH释放量； 所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内SOD的活力； 所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内CAT酶的活力； 所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内GSH-Px的活力； 所述具有PC12细胞保护作用是指能抑制由H2O2损伤引起的细胞内ROS含量升高； 所述具有PC12细胞保护作用是指能够稳定线粒体膜电位。7. 权利要求1所述黄酮类化合物的制备方法，包括以菥蓂子为原料，经步骤A浸膏提取、 步骤B有机溶剂萃取、步骤C反相硅胶柱层析、步骤D高效液相色谱分离步骤制备而得，其特 征在于：： A、 浸膏提取:取菥蓂子，粉碎至20~40目，用90%~100%乙醇回流提取2~5次，每次40 ~80min，合并提取液、过滤，减压浓缩至浸膏； B、 有机溶剂萃取:A步骤浸膏用蒸馏水混悬，加入等体积石油醚萃取5~8次，收集水相 溶液，加入等体积乙酸乙酯萃取5~8次，收集水相溶液，加入等体积正丁醇萃取5~8次，收 集正丁醇相溶液，减压浓缩至浸膏； C、 反相硅胶柱层析:B步骤浸膏用乙醇溶解，进行反相硅胶柱层析；以体积配比为1:9~ 6:4的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩； D、 高效液相色谱分离:C步骤洗脱液的1:9部分进一步用高效液相色谱分离纯化，即得 所述的黄酮类化合物。8.根据权利要求7所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于:满足以下任意一项： 所述步骤A中的乙醇浓度为90%~100% ;或 所述步骤B中浸膏用蒸馏水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取除杂，取萃取后的水 相溶液，用正丁醇萃取，收集正丁醇相溶液;或 所述步骤C中乙醇-水溶液体积配比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5或6:4中的至少一种;或 所述步骤D中高效液相色谱分离纯化是采用20mm X 250mm，5μηι的Cis色谱柱，流速为5~ 20ml/min，流动相为30~45%的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样190~210μ1， 收集10.2~15.2min的色谱峰，多次累加后干燥。
【专利摘要】本发明属于医药领域，具体涉及一种黄酮类化合物TA31a及其制备方法与用途，所述的化合物结构式如式1，命名为6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4＇＇＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷，呈黄色粉末状，分子式为C33H40O20。所述化合物的制备方法，其特征在于以菥蓂子为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、反相硅胶柱层析、高效液相色谱分离纯化。本发明化合物具有明确的抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫增强活性以及PC12细胞保护作用，为临床应用提供了一种新的选择。
【IPC分类】C07H1/08, A61P39/06, A61P39/00, A61P35/00, A61P37/04, C07H15/26, A23L33/105
【公开号】CN105524131
【申请号】CN201610006089
【发明人】余梦瑶, 罗霞, 许晓燕, 魏巍, 江南
【申请人】四川省中医药科学院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月6日