2(A)为乙醇总提取物的分析型液相色谱图，图2(B)为乙酸乙酯萃取 部位的分析型液相色谱图，图2(C)为分离纯化得到的7个化合物的分析型色谱图叠加图。
[0070] 采用的HPLC条件为：高效液相色谱仪（LC-20A，Shimadzu，Japan)，色谱柱为 Ultimate?XB-C18column(Welch Materials Inc. ;4.6mmX250mm，5.0ym)，波长为203nm和 254nm，进样体积为10yL，柱温为30°C，流速为lml/min。色谱分析的溶剂系统为乙腈-水，梯 度洗脱程序为：10 _42%(￥八），0-30111；[11;42-60%(￥八），30-60111；[11;100%(￥八），60-70111；[11。 系统平衡l0min。
[0071] 采用峰面积归一化法计算，化合物5纯度达到95%以上。
[0072] 4.化合物5的结构鉴定
[0073]将得到的化合物5用薄层色谱法(TLC)分析，均为一个圆形单点，同时用HPLC在不 同洗脱体系中洗脱，得到的均为一个单峰。将化合物进行各种光谱(UV、IR、NMR、MSb1/?Ji 据及鉴定结果如下：
[0074] 质谱数据：（-)ESI-MS m/z 537.2[M-H]_，说明其MW=538;分子式推断为： C30H18〇1Q;不饱和度 Ω =22;
[0075] υνλ^^ :210nm、268nm、330nm，黄酮类化合物特征吸收峰；
[0076] IR\^g(cm-0:3588(芳环中 0H)、3423(芳环中 C-H)、1654(芳环中 C = 0)、1610(芳 环中 C = C)、1500(芳环中 C = C)、1289(00)、1028(C-0)、838(芳基对位取代）。
[0077] 1H NMR谱中芳香区有13个氢，13C NMR谱中有2个羰基碳0182.3、5176.5)，28个芳 香碳，提示该化合物结构为双黄酮类。1H NMR谱中，有2个羟基氢12.86( 1H，s)、12.24(1H， 8)。根据耦合常数推断8.01(2!1，(1，1 = 8.4取）、7.86(2!1，(1，1 = 8.8取），7.26(2!1，(1，了 = 8.8抱）和6.91(2!1，(1，了 = 8.8抱）构成了2个厶厶/88/系统。6.56(1!1，8，了 = 1.2!^)，6.50(1!1，8， 了=1.2他），6.27(1!1，8，1=1.6抱）和5.88(1!1，8，1=1.6抱）构成2对间位耦合氢，此外尚有 一个单氢6.85(1!1，8)。130匪1?信号572.9、599.4、594.7、599.4可以推断出，两个黄酮母环八 上的C6和C8均未被取代。
[0078] 结合1H NMR谱和13C NMR谱全部数据(详见表1)，鉴定化合物5具有以下结构式：
[0079]
Ο ο
[0080] 表1化合物5的核磁共振数据(DMS0-d6，400MHz)
[0081]
[0082] 实施例2化合物5体外抗癌活性评价
[0083] 将上述制备得到的化合物5用于在以下人肿瘤细胞株做体外抗癌活性评价。
[0084] 1.化合物溶液配制：精密称取一定量化合物5,用二甲基亚砜(DMS0)溶解，用各个 细胞生长的培养基依次稀释成浓度为500、250、125、62.5、31.25yg/mL的5个浓度的供试液， 阳性对照药多柔比星准备液以各个细胞生长的培养基分别依次稀释成浓度为5、2.5、1.25μ Μ的3个浓度供试液。
[0085] 2.细胞株和细胞培养
[0086] 七种人肿瘤细胞株，包括5种为贴壁型肿瘤细胞株:人胃癌细胞株(ΜΚΝ-45)、非小 细胞肺癌(Α549)、鼻咽癌(CNE1、CNE2)、大细胞肺癌(PC-9); 2种为悬浮型的肿瘤细胞:人急 性早幼粒细胞白血病细胞株(HL60)、人慢性粒细胞白血病细胞株(Κ562)。这些细胞株均购 自上海中科院细胞库，由福建医科大学药学院冻存。
[0087] 上述七种肿瘤细胞株的冻存细胞从液氮中取出复苏后，分别培养于25cm2培养瓶 中，用各种细胞株对应的培养条件培养(见表2)。待细胞生长传代6-8次，细胞在瓶底融合率 为80 %左右时，即为对数生长期细胞，用0.25 %的胰酶溶液消化传代。细胞悬液按照各类细 胞生长速度，分别调节细胞悬液至适当浓度接种于96孔板中。
[0088] 表2 7种肿瘤细胞株及对应培养条件
[0089]
[0090] 3 .MTT法测定化合物5对七种细胞的抑制率
[0091] 分别用以上制备的不同浓度双黄酮供试溶液干预所述七种肿瘤细胞株72h，每个 实验孔加入MTT溶液(5mg/mL)10yL，继续培养4h后，移去培养孔中液体后加入200yL的DMS0， 并充分震荡使孔底甲瓒充分溶解。于酶标仪492nm波长下测定各个孔的0D值，计算其抑制 率。每个样品对每种肿瘤细胞的抑制作用实验均平行三次。
[0092]测定结果分析，采用0rigin7.5软件分析处理每个样品孔测得的0D值，计算人肿瘤 细胞株的半数抑制率(IC50值，mean土S.D.)，结果见表3。
[0093] 表3化合物5对七种人肿瘤细胞株的半数抑制率(mean土S.D.，n = 3)
[0094]
[0095] 化合物5对所选的七种人肿瘤细胞株均有很好的抑制作用，其IC50在13.2±0.91 ~49.29±2.8yg/mL范围内，抑瘤谱广。其中，化合物5对A549抑制作用显著。
[0096] 实施例3化合物5动物模型体内抗癌活性评价
[0097] 将上述制备得到的化合物5用于在以下人肿瘤细胞株做体外抗癌活性评价。
[0098] 1.细胞株和实验动物
[0099]人非小细胞肺癌细胞株A549细胞，购自上海中科院细胞库，由福建医科大学药学 院冻存。
[0100] 3-4周龄BALB/c裸鼠，体重18±2g(雄性），购自上海斯莱克实验动物有限责任公 司，实验动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，动物合格证编号：2007000537438。
[0101]裸鼠每6只一笼饲养于SPF级层流系统中，每日给予裸鼠标准食物和饮水，保持光 照和避光循环实验（12/12h)，室温25±2°C，湿度为50±10%，每天更换高压蒸汽灭菌后的 饮用水和垫料。实验前在保持室饲养一周。
[0102] 2.化合物5供试液配制
[0103] 化合物5微溶于水，水溶液(或生理盐水溶液)呈酸性。当调节其pH值到注射液规定 范围（6.0-8.0)，样品溶解度有所增大，但依然较低，静置容易沉降。故选择适当的助溶剂来 增加其溶解度。通过对比了吐温-80 (终浓度0.02-2 %，v/v)、PEG-400 (终浓度〈40 %，v/v)、 1，2-丙二醇（终浓度〈40%，￥八）、甘油(终浓度〈30%，￥八)和01(：-似(终浓度1-5%。，《八)对 样品在水溶液的助溶作用。最终发现，各类助溶剂在注射剂允许的添加浓度范围中，PEG-400 和吐温-80 对样品水溶液的助溶效果较好。由于二者助溶效果相当 ，考虑到含有吐温的 剂型溶血现象比较普遍，故最终选择加入PEG-400作为助溶剂。通过筛选不同比例的PEG-400 助溶效果 ，发现 PEG-400为10 % 时助溶效果理想。 故选择 PEG-400添加量为10 %。
[0104] 精确称取6mg化合物5粉末，加入助溶剂PEG-400(lOOyL)涡旋、超声，充分溶解后， 逐步加入少量的生理盐水，并调节pH为7.4左右，补足溶液至lmL。
[0105] 3.阳性对照药的配制
[0106]精密称取一定量的注射用多柔比星粉末，加入生理盐水配成〇.4mg/mL供试液。该 供试液避光