5] 实施例1
[0036] 联节类化合物的提取方法如下步骤操作：
[0037] 1)试验仪器与试剂准备：
[0038] 新鲜油茶叶：采自湖南省天际岭国家森林公园，由中南林业科技大学谭晓风教授 鉴定为普通油茶(Camellia oleifera Abel.)叶；
[0039] 甲醇、乙腊:美国FI址a公司；
[0040] 乙醇：国药集团；
[0041] 二氯甲烧:国药集团；
[0042] 二甲基亚讽(DMS0):国药集团；
[0043] 超声波清洗器，AS系列，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。
[0044] 旋转蒸发仪，R-205B，上海申胜仪器公司；
[0045] D-101大孔树脂:天津富邦化工科技有限公司；
[0046] 柱色谱硅胶:青岛海洋化工厂生产；
[0047] 薄层色谱硅胶板:青岛海洋化工厂生产；
[004引ZFB型Ξ用紫外分析仪:上海康华生化仪器制造有限公司；
[0049] 恒溫水浴锅:北京医疗电子仪器厂；
[0050] 超声波清洗器(JK-500B):合肥金尼克机械制造有限公司；
[0051] 氮吹仪:北京优扇联合科技有限公司；
[0052] 分析用液相色谱:依利特高效液相色谱，配UV1201检测器；
[0化3] 分析色谱柱:化itary C18 4.6mmX250mm，5ym，浙江华谱新创科技有限公司；
[0054] 审恪色谱柱:C18,10mm X 250mm，5μπι，浙江华谱新创科技有限公司；
[0055] 半制备液相色谱:创新通恒的LC3000型；
[0化6] DAC制备色谱:创新通恒公司LC6000高效液相色谱；
[0057] 2)具体提取方法:将自然阴干的油茶干燥叶粉碎成60目W上的粉末，取20kg分两 批用50%乙醇按料液比1:3加热回流重复提取2次，每次提取化，加热提取的溫度控制在70 °C，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积一半的粗提液样品， 备用；
[0058] 3)油茶50%醇提取物样品经过质谱分析，鉴定18个组分，其中的花青素，W及提取 液中的大量的多糖、蛋白质，较质等亲水性成分，复杂且难于分离，都不作为本发明研究的 重点。因此需用D101型大孔吸附树脂纯化，方法是：用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸 附树脂，用水洗到无醇味，取一半提取液分两次上样，依次用水、20%乙醇、80%乙醇洗脱， 每个梯度洗脱4倍柱体积，根据化C和HPLC分析结果，各部位合并浓缩，其中80 %乙醇部位总 样-硅胶柱层析合并组分色谱图如图1所示，对DlOl大孔树脂洗脱得到的Ξ个部位进行分析 显示，水洗部位含有大量多糖和蛋白质等，20%乙醇部位可能含有茶皂巧等中等极性化合 物，但运一部位有大量有色物质干扰，而且样品的紫外吸收较弱，分离难度也较大。80%乙 醇部位富含联节及酪巧类成分，因此作为重点分离的目标。其中，流动相A为甲醇，Β为水;洗 脱程序:〇-l〇min 50%A，10-20min 80%A，20-21min 100%A;检测波长254nm，进样量 10化；
[0059] 4)将采用80%乙醇洗脱得到洗脱液样品浓缩干燥(约150g)，溶解于一定比例的二 氯甲烧-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200-300目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空 白层装填硅胶约800g，流动相为二氯甲烧-甲醇（10:1-1:3梯度洗脱），每5001^收集为一个 流份，经过TLC检测合并为 1-2+2'，3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'， 17-19+14'，20-2化15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-：34'，35'-44'，41-47,48- 64,65,66-67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共计24个组 分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号加 W区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接）；
[0060] 5)经过液相检测，选取其中的第10个单位的洗脱液27-40进行细分，利用DAC制备 色谱分离，色谱图如图2所示，60%甲醇-水恒定洗脱，得到Ξ个单体化合物W及一个含多个 化合物的复杂组分fr.A(865mg)，将该流分溶解于一定比例的二氯甲烧-甲醇中，拌入2.5g 薄层层析硅胶（200-300目），水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烧-甲 醇-水(100:12:1恒定洗脱），每40mL收集为一个流份，经过化C检测合并为1，2，3，4-12。第Ξ 个流份利用半制备液相色谱分离，25%乙腊-水恒定洗脱，色谱图如图3所示(加图），得到目 标化合物，即图中的C0-9。
[0061] 下面对得到的目标化合物进行结构鉴定，所用的仪器与试剂:NMR:核磁共振所有Η 谱全为400MHz，所有1化谱均为lOOMHz。核磁共振检测条件:核磁共振一维和二维脉冲序列采 用仪器的相应标准程序，1H-NMR谱采样脉冲宽度90°，累加次数32; 13C-NM时普采样脉冲宽度 90°，累加次数，2000，H-H COSY、HSQC、HMBCS种试验采样数据阵均为F2 XFi = 2048 X 256，零 填充至2048 X 1024进行FT变换，窗函数处理谱图。
[0062] 具体鉴定过程按照如下操作进行：
[0063] 化合物C0-9,白色无定形粉末，Ξ氯化铁反应呈阳性，Molish反应呈阳性，表明结 构中含酪径基和糖基，图4中HRESIMS (Positive):m/z 559.1829[M+H] +，（Calcd for C28H3i0i2,559. 17 ) , 3 29.0870 [ M+H-d i hy dr or e vera tr ο 1 ]887.260 5 [ 2M + H- dihy化oreveratrol]，结合IH-NMR及"C-NMR确定化合物CO-9的分子式为C2抽3日〇12。
[0064] iH-NMR 图谱如图5 所示，从谱图中可 W 看出，S6.91(2H，d，J = 8.5Hz)，S6.97(2H，d， J = 8.甜ζ)，δ6.11 (2H，d，J = 1.9Hz)，S7.09(2H，s) ,6.06(lH，br S)均为苯环上的质子信号， 且存在四组对称结构，S3.86(3H，s)为连氧甲基质子信号，54.81(化(1，1 = 7.2化)为糖端基 质子信号，由于J1，2值大于7.0，根据经验判据可知糖巧键为β构型。
[0065] 将化合物C0-9推测的结构与文献中已报道的化合物相似物1-战，5/二径基)苯基 2-(4"-0-β-0-化喃葡萄糖基)苯乙烧对比，部分碳谱数据高度一致，可推测化合物C0-9是二 氨白襲芦醇巧的衍生物。
[0066] 结合所有核磁谱图及分析，化合物C0-9鉴定为二氨白襲芦醇-4'-0-[护'-0-(4""- 甲基没食子酷基）]-e-D-化喃葡萄糖巧。查Scifinder数据库，该化合物为新物质，分子量为 558，纯度可达95wt % W上，化学结构式为：
[0067]
[006引实施例2
[0069] 联节类化合物的提取方法如下步骤操作：
[0070] 1)所用的试验仪器与试剂准备与实施例1基本相同；
[0071] 2)具体提取方法:将自然阴干的油茶干燥叶粉碎成70目W上的粉末，取20kg分两 批用60%乙醇按料液比1:3加热回流重复提取2次，每次提取化，加热提取的溫度控制在80 °C，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积一半的粗提液样品， 备用；
[0072] 3)油茶50%醇提取物样品经过质谱分析，鉴定18个组分，其中的花青素，W及提取 液中的大量的多糖、蛋白质，较质等亲水性成分，复杂且难于分离，都不作为本发明研究的 重点。因此需用D101型大孔吸附树脂纯化，方法是：用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸 附树脂，用水洗到无醇味，取一半提取液分两次上样，依次用水、30%乙醇、75%乙醇洗脱， 每个梯度洗脱4倍柱体积，根据化C和HPLC分析结果，各部位合并浓缩；
[0073] 4)将采用75%乙醇洗脱得到洗脱液样品浓缩干燥(约150g)，溶解于一定比例的二 氯甲烧-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200-300目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空 白层装填硅胶约800g，流动相为二氯甲烧-甲醇（10:1-1:3梯度洗脱），每4001^收集为一个 流份，经过TLC检测合并为 1-2+2'，3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'， 17-19+14'，20-2化15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-：34'，35'-44'，41-47,48- 64,65,66-67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共计24个组 分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号加 W区分，部分流份进行