交叉合并，用加号衔接）；
[0074] 5)经过液相检测，选取其中的第10个单位的洗脱液27-40进行细分，利用DAC制备 色谱分离，65%甲醇-水恒定洗脱，得到Ξ个单体化合物W及一个含多个化合物的复杂组分 打.A(865mg)，将该流分溶解于一定比例的二氯甲烧-甲醇中，拌入2.5g薄层层析硅胶(200- 300目），水浴挥干，空白层装填硅胶约40g。流动相系统为二氯甲烧-甲醇-水（100:12:1恒定 洗脱），每50mL收集为一个流份，经过化C检测合并为1，2，3，4-12。第Ξ个流份利用半制备液 相色谱分离，30 %乙腊-水恒定洗脱，得到目标化合物，对该化合物进行结构鉴定的过程如 下：
[0075] "C-醒R图谱如图6所示，从谱图中可W看出，δ166.24是脂幾基特征信号，95.00- 160.(K)ppm范围内包含一系列不饱和碳信号，其中有四组信号两两重叠，提示化合物中存在 对称结构，δ59.43是连氧-甲基碳信号，δΙΟΙ. 03是糖端基信号，60.00-80.0化pm范围内有连 氧碳信号，通过与文献对比可确定该糖基为葡萄糖基。
[0076] 目标化合物的H-H COSY如图7所示，从谱图中可W看出，δ6.9UH-2 '，6 '）与δ6.97 化-3 '，5 '）形成典型的对位取代苯的ΑΑ> ΒΒ >自旋系统；δ6.06化-4")与6.1UΗ-2"，护）形成 典型的间Ξ取代苯Α&的自旋系统；δ7.09化-2""，6"")形成典型的1，3,4,5-四取代苯的自 旋系统；δ2.73化-1)与2.64化-2)形成一组Α2Β2的自旋系统，即-C此C此-单元。因此，初步推 断化合物中含有一个对位取代苯、一个间Ξ取代苯、一个1，3，4，5-四取代苯及一组-C出(:出- 单元。
[0077] 通过HSQC(图8)将碳氨信号一一对应，再利用HMBC将结构片段拼接起来。对目标化 合物的歷齡图进行解析如下：如图9所示，62.73化-1)与6135.83((：-1'）、128.90((：-2'，6'）， δ2.64化-2)与δ144.08(C-r )、106.59(C-2"，护）相关，将间Ξ取代苯，一组-C出C出-单元和 对位取代苯Ξ个结构片段连接起来，结合已经鉴定的化合物C0-12及根据之前的推断，该化 合物的结构中还有一个葡萄糖基，一个四取代苯基，一个脂幾基和一个连氧甲基，利用HMBC 可将运些基团与母核连接起来，其中S4.81(Glc-H-l)与Sl55.66(C-4'）相关，提示葡萄糖基 与母核的 4'位径基成巧；S4.39(Glc-H-6a)和4.59(Glc-H-6b)与 δl66.24(C = 0)，δ7.09化- 2""，6"")与δl66.24(C=0)相关，提示四取代苯基与脂幾基直接相连即没食子酷基，同时， 脂幾基与葡萄糖6位连接。S3.86(4""-0-CH3)与Sl39.87(GA-4"")相关，提示甲氧基连接在 没食子酷基的4位。
[0078] 结合所有核磁谱图及分析，目标化合物鉴定为二氨白襲芦醇-4'-0-[护'-0-(4""- 甲基没食子酷基）]-e-D-化喃葡萄糖巧。查Scifinder数据库，该化合物为新物质，分子量为 558，纯度可达98wt % W上，化学结构式为：
[0079]
[0080] 总之，经过本发明实施例的提取方法得到的目标化合物经过结构鉴定后均具有相 同的结构，而且运种化合物属于首次发现，对后续研究具有一定的指导意义。
[0081 ] 实验例1
[0082]将本发明实施例1提取得到的目标化合物进行如下实验：MTS法检测化合物对 RAW264.7细胞增殖活性的影响。将细胞接种于96孔板，分别设空白对照组、试验组（1化g/ mL、30yg/mL和1 OOyg/mLS个不同浓度组），每组设Ξ个复孔。每孔力日MTS溶液20化，解育1 -2 小时，利用酶标仪在波长490nm条件下测其吸光值。发现试验组(Ξ组)与对照组吸光度无显 著差异，说明化合物不会影响RAW264.7细胞的增殖活性，从运个实验可W看出本发明提取 得到的目标化合物对机体没有任何副作用；
[0083] 然后再将本发明实施例1的目标化合物进行如下实验:利用浓度为lug/mL的LPS诱 导RAW264.7细胞建立炎症模型。分别设空白对照组、LI^诱导组、LPS与试验组(共Ξ组，化合 物浓度分别为10yg/mL、30yg/mL和lOOyg/mL)，试验组与LPS诱导组相比，通过RT-qPCR、 Western blot等方法检测，发现试验组均可显著抑制RAW264.7细胞中IL-ie、TNF-a、iNOS等 相关炎症因子的转录与表达水平，通过该实验可W发现本发明的目标化合物具有抑制炎症 从而达到进一步抑制癌症等恶性肿瘤的效果，而且效果显著。
[0084] 通过将本发明实施例2提取得到的目标化合物进行实验也呈现相同的结果。
[0085] 其中，该实验中所用的实验仪器主要有:上海团结仪器制造有限公司的倒置生物 显微镜，日本岛津生产的分析天平，德国eppendorf公司生产的低溫离屯、机，北京君意公司 生产的电泳仪、凝胶成像仪、垂直板电泳槽W及水平电泳槽，英国化GA公司生产的超纯水系 统，六一仪器厂生产的水平摇床等；所用的实验试剂主要有：LPS脂多糖、MTS、H-DMEM培养 基、Trizol试剂、引物、异丙醇、氯仿、漠酪蓝、漠化乙锭、胎牛血清等。
[0086] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可W作出许多其它的更改和修改。因此，运意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有运些变化和修改。
【主权项】
1. 一种联苄类化合物，其特征在于，该联苄类化合物的化学结构式为：2. 权利要求1所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤： (A) 将油茶叶经过热提取、浓缩得到浓缩液，过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏 水、20-30wt %乙醇、75-80wt %乙醇溶液洗脱； (B) 将采用75-80wt%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲 烷-甲醇，每400_500mL为一个单位收集洗脱液，对第10个单位的洗脱液进行继续分离提取 得到多化合物提取液； (C) 将多化合物提取液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每40-50mL为一个单 位收集洗脱液，对第3个单位的洗脱液进行继续分离提取，即得。3. 根据权利要求2所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(A)中，油茶 叶热提取的温度控制在70-80°C。4. 根据权利要求3所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(A)中，热提 取之前先将油茶叶粉碎成60目以上的粉状;优选地，热提取采用50wt%以上的乙醇为溶剂 进行提取。5. 根据权利要求2所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(B)中，75-80wt %乙醇溶液洗脱得到的洗脱液先进行浓缩干燥后，溶解于二氯甲烷-甲醇中，再进行硅 胶层析； 优选地，硅胶层析过程中所用的硅胶目粒度控制在200-300目。6. 根据权利要求2所述的油茶叶提取物中的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所 述步骤(B)中，对第10个单位的洗脱液进行液相色谱检测后，根据检测结果采用甲醇-水溶 液进行洗脱得到多化合物提取液。7. 根据权利要求6所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述甲醇-水溶液的 质量百分比浓度为60-65%。8. 根据权利要求2所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(C)中，第3 个单位的洗脱液利用半制备液相色谱检测后，根据检测结果采用乙腈-水溶液进行洗脱分 离得到目标化合物。9. 根据权利要求8所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述乙腈-水溶液的 质量百分比浓度为25-30%; 优选地，所述步骤(C)中，硅胶层析过程中所用的硅胶目粒度控制在200-300目。10.根据权利要求2-9任一项所述的联苄类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤 (C)中，最后所得的提取物中联苄类化合物的含量在95wt%以上。
【专利摘要】本发明提供了一种联苄类化合物，化学名称为二氢白藜芦醇-4’-O-[6”’-O-(4””-甲基没食子酰基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，提取方法如下：过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏水、乙醇溶液洗脱；将采用75-80wt％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，每400-500mL为一个单位收集洗脱液，对第10个单位的洗脱液进行继续分离提取得到多化合物提取液；将多化合物提取液进行硅胶层析，每40-50mL为一个单位收集洗脱液，对第3个单位的洗脱液进行继续分离提取即得目标化合物。本发明实施例的联苄类化合物为一种新型的单一化合物，纯度高，成分明确，无任何杂质，属于首次提取纯化得到。
【IPC分类】C07H15/203, A61P29/00, C07H1/08, A61P35/00
【公开号】CN105669790
【申请号】CN201610129936
【发明人】曹清明, 付红军, 王萌皓, 何洁, 钟海雁, 胡小龙
【申请人】中南林业科技大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月8日