一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。

背景技术：

活性氧(ROS)是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧原子的物质总称，包括自由基(羟基自由基和超氧阴离子自由基等)和非自由基(过氧化氢和次氯酸等)。各种活性氧(ROS)中，过氧化氢是生命系统中最重要的一种，是大部分氧化酶过程中的产物并参与很多生物体内调节过程。在正常生理浓度下，H₂O₂对生物正常的生理过程是有益的，它们参与细胞内蛋白质的可逆氧化，调节蛋白质的磷酸化到基因表达等细胞过程。过氧化氢在细胞生长和增殖方面起着十分重要的作用。但是，体内异常的H₂O₂会导致许多疾病的产生，例如炎症性疾病，癌症，糖尿病，心血管疾病和神经系统性疾病。因此，适时准确地检测体内过氧化氢的含量对于相关疾病的预防、诊断以及病理的研究具有十分重要的指导意义。

然而，目前对H₂O₂的检测缺少靶向性，不能对细胞内某一特定的细胞器内的过氧化氢进行检测，特别缺少对细胞内线粒体靶向的过氧化氢探针，从而缺少研究细胞病变过程中对线粒体中过氧化氢浓度变化情况的检测工具。

技术实现要素：

针对目前过氧化氢分子荧光探针检测所面临的问题，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快以及线粒体靶向性的过氧化氢荧光探针。

本发明还提供了上述过氧化氢分子荧光探针的制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针，其结构式如式I所示：

简记为Mito-H₂O₂。

上述的线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：

(1)将1eq的4-溴二乙胺基苯胺、0.1eq的醋酸钯和0.3eq的三(邻甲基苯基)磷溶于由Et₃N和DMF按照体积比5:3组成的溶液中，在氮气保护的条件下将4eq的4-乙烯基吡啶注入上述溶液中，加热反应；用TCL板检测反应，反应完全后，分离提纯可得到化合物1，化合物1结构式如下所示：

(2)将1eq的化合物1和1eq的对苄基溴频哪醇硼酸酯溶于乙腈中，氮气保护，加热回流反应，用TCL板检测反应，反应完全后，分离提纯可以得到目标化合物Mito-H₂O₂。

上述的过氧化氢荧光探针的合成路线如下：

所述步骤(1)中加热反应温度为120℃，反应时间为14小时。

所述步骤(1)中分离提纯的具体方法为：将反应产物先用二氯甲烷萃取2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，最后用柱色谱层析进行分离；所述柱色谱分离的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:10。

所述步骤(2)中加热反应的温度为85℃，反应时间为7小时。

所述步骤(2)中分离提纯的具体方法为：将反应产物减压旋干溶剂得粗产品，然后柱色谱层析分离；所述柱色谱层析分离的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1:20。

本发明还提供了一种上述的过氧化氢分子荧光探针的应用，所述荧光探针可以应用于水环境和生物细胞体系中过氧化氢的含量传感检测；所述的传感检测包含荧光检测、细胞成像检测。

本发明的优点是：(1)探针的合成只需要两步就可以完成，且后处理过程相对简单；(2)本发明实现了H₂O₂分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。(3)此探针可以应用于检测细胞内线粒体中的过氧化氢的检测，通过与商业化线粒体染料进行比较，其对线粒体内过氧化氢成像的重合率高，两种染料的共定位系数为0.90，说明此探针可以作为细胞内线粒体内过氧化氢检测探针。基于此探针的特异性且显著的颜色变化，该试剂也可作为显示水溶液中过氧化氢分子存在的专一性指示剂，可进行对过氧化氢实时定性及定量的荧光检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的过氧化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。

附图说明

图1是实施例一中探针Mito-H₂O₂的¹H NMR图谱；

图2是探针Mito-H₂O₂随过氧化氢的加入荧光谱图的变化情况；

图3是探针Mito-H₂O₂对不同离子和分子的选择性荧光谱图；

图4是探针Mito-H₂O₂对不同离子和分子的选择性柱状图数据，其中1.Blank；2.Br^-；3.Cys；4.F^-；5.Fe²⁺；6.Fe³⁺；7.GSH；8.HClO；9.Hg²⁺；10.NO；11.NO^2-；12.NO^3-；13.S^2-；14.过氧叔丁醇；15.过氧叔丁谜；16.H₂O₂；

图5是探针Mito-H₂O₂溶液在过氧化氢加入前后溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化；

图6是探针Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针检测外源性过氧化氢荧光成像图；其中a)参比样细胞明场成像图，b)参比样绿通道荧光成像图，c)参比样明场与荧光成像图重合图片，d)探针浓度为10μM加入到HeLa细胞中培养30min后明场图，e)过氧化氢50μM加入后30min后的绿通道荧光成像图，f)明场与荧光成像图重合图片；

图7是Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针检测外源性过氧化氢荧光成像图与商业化染料线粒体红的共定位成像图。a)探针浓度为10μM与线粒体红10nM加入到HeLa细胞中培养30min后明场图，b)加入过氧化氢并培养30min后绿通道荧光成像图，c)商业染料线粒体红荧光成像图，d)明场、绿通道与红通道叠加图，e)绿通道与红通道叠加图，f)绿通道与红通道叠加箭头部分荧光强度比较，g)绿通道与红通道叠加部分强度散点图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。

实施例1

化合物1的合成：

将4-溴二乙胺基苯胺(1.0g，2.4mmol，1eq)，醋酸钯(50mg，0.2mmol，0.1eq)，三(邻甲基苯基)磷(150mg，0.5mmol，0.3eq)，溶于(体积比Et₃N：DMF＝5:3)30mL溶液中，氮气保护，然后将4-乙烯基吡啶(1.0g，9.6mmol，4eq)用注射器打入上述溶液中。120℃加热，反应14小时。用TCL板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取2-3次，饱和食盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到化合物1，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:10。化合物1的产率为75％。

化合物Mito-H₂O₂的合成：

将化合物1(100mg，0.396mmol，1eq)，对苄基溴频哪醇酯(117.6mg，0.396mmol，1eq)，溶于3mL乙腈中，氮气保护，85℃加热回流反应7小时，用TCL板检测反应，反应完全后，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离得到目标终产物，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷＝1:20。得产物Mito-H₂O₂，产率为68％。此化合物的氢谱为：¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.03(d,J＝6.4Hz,2H),7.84(d,J＝7.9Hz,2H),7.79(d,J＝6.0Hz,2H),7.59(d,J＝16.1Hz,1H),7.53(d,J＝7.9Hz,4H),6.85(d,J＝15.7Hz,1H),6.75(s,2H),6.03(s,2H),3.10(s,6H),1.34(s,12H).具体的合成谱图如附图1所示。

实施例2

化合物Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针随过氧化氢加入当量的增加荧光谱图的变化

取实施例1制备的Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量(0-10eq)的过氧化氢标准溶液，用PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝8.3)与DMF体积比为2:1的溶液稀释至3mL，以410nm为激发光测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着过氧化氢加入当量的增加荧光逐渐增强。

实施例3

化合物Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针对不同分子或离子的选择性

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的过氧化氢标准溶液，1h后以410nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，结果见图3和图4。由图3和图4可以发现，其他金属离子对化合物Mito-H₂O₂的荧光几乎没有影响，而过氧化氢溶液的加入使化合物Mito-H₂O₂的荧光显著增强。

实施例4

化合物Mito-H₂O₂荧光探针对过氧化氢的可视化检测

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL的样品管当中，加入80摩尔量的过氧化氢标准溶液，结果如图5所示，过氧化氢可以使化合物Mito-H₂O₂荧光探针的PBS：DMF体积比为2:1的缓冲溶液下荧光颜色发生明显的变化，伴随着紫外灯下肉眼可视的过氧化氢诱导荧光探针发出明亮的黄色荧光(图5)，说明是该化合物是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5

化合物Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针对细胞外源性过氧化氢荧光成像

我们将本发明探针应用于HeLa细胞中对外源性的过氧化氢进行荧光成像应用。具体操作步骤如下：

将育有HeLa细胞的两个培养皿进行编号，向两个培养皿中分别加入10μM Mito-H₂O₂过氧化氢探针DMSO溶液，并在二氧化碳培养箱中培养30min后用PBS对细胞进行洗涤三次。一号培养皿作为参比不加入分析样，向二号培养皿中加入50μM的过氧化氢水溶液后在培养箱中培养30min。用共聚焦显微镜对培养皿中的细胞进行荧光成像。首先参比培养皿进行成像。用488nm的激光进行激发，在明场通道可以观看到细胞的轮廓图，而用绿色通道(500-550nm)对细胞进行荧光信号采集时观察不到荧光发射。对二号培养皿进行成像研究发现在绿色通道下可以清醒的看到探针对H₂O₂的荧光成像图。此实验可以说明探针Mito-H₂O₂能够在HeLa细胞内对外源性的H₂O₂进行荧光成像。

实施例6

化合物Mito-H₂O₂过氧化氢荧光探针对细胞外源性过氧化氢荧光成像与商业线粒体染料共定位比较

我们将本发明探针应用与HeLa细胞中与商业化的线粒体染料进行共定位实验，说明本探针可以定位到线粒体中，并对线粒体内的外源性的过氧化氢进行荧光成像应用。具体操作步骤如下：将10μM Mito-H₂O₂过氧化氢探针DMSO溶液和商业化线粒体染料-线粒体红10nM加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min后，向体系中加入50μM的过氧化氢水溶液后，再等待30min后用共聚焦显微镜进行成像，此时用蓝光(Ex＝488nm)进行激发并用绿色通道(500-550nm)对细胞进行荧光信号采集可以观察到有荧光信号发出，此为Mito-H₂O₂过氧化氢探针与过氧化氢响应后发射的光，用绿光(Ex＝561nm)进行激发并用红色通道(570-620nm)对细胞进行荧光信号采集，可以观察到在此通道有荧光信号发出，此为商业化染料线粒体红发出的红光，用软件进行处理可以得出两种染料的共定位系数为0.90，说明本探针可以对细胞线粒体中的过氧化氢进行荧光成像，具体结果图如图7所示。