莫哈韦芽孢杆菌KJS‑3用于分解苯酚的用途的制作方法

本发明涉及莫哈韦芽孢杆菌KJS-3用于分解苯酚的用途，属于废水处理领域。
背景技术：
：现在各种工业废水中不仅有有机物质还包含有分解困难的难降解性化合物。这些难降解性化合物中，不仅对人体产生毒性而且因自然分解困难而成为造成环境污染的主要物质之一，从而造成其环境残留问题的出现。特别随着化学工业的快速发展，各种工艺中使用的芳香族化合物具有苯环结构，其不仅会对大部分的人体产生毒性，因自然界中分解困难还会成为造成环境污染的主要原因物质之一，而且其使用量还在不断增加中。苯酚已被美国环保局认定为主要污染物质的化学物，其浓度200mg/l以下也会妨碍微生物生长，是废水中较难处理的主要环境污染物质。国内外利用微生物处理废水的研究层出不穷。苯酚系化合物是依靠微生物通过羟化形成邻苯二酚中间代谢产物，再依靠酶的作用使芳香环分裂，一种是以邻裂途径分解成琥珀酸和乙酰辅酶A，另一种是以间位途径分解成乙醛和丙酮酸(Aldrich，T.L.，Frantz，B.，Gill，J.F.，Kilbane，J.J.andChakrabarty，A.M.1987.CloningandcompletenucleotidesequencedeterminationofthecatBgeneencodingcis，cis-muconatelactonizingenzyme.Gene52，185-195.)。但是这种代谢过程中现有微生物的效率很低，废水中含有的各种废弃物很难迅速的分解代谢掉。而且这些中间物质溶解于废水中的话，相关的微生物的活性会降低从而造成废水处理效率进一步下降，并且因为那些化学物质的毒性成分排放到自然界中，还会造成二次环境污染。苯酚化合物是在工业生产中大量使用的物质，相关化学废水处理是个严峻的问题。所以苯酚化合物分解微生物的筛选，在各种废水处理应用中十分重要，为了针对这类化合物的微生物的筛选和分离，分离源和代谢物质的选定变得十分重要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供莫哈韦芽孢杆菌KJS-3用于分解苯酚的用途。本发明所述的莫哈韦芽孢杆菌KJS-3对苯酚的分解能力有改善，可用于含有苯酚的各种污水废水的处理。本发明针对化学工厂和造纸工厂等各种工业企业的废水处理，筛选出具有优秀清除能力的微生物菌株莫哈韦芽孢杆菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)。莫哈韦芽孢杆菌(bacillusmojavensis)KJS-3于2008年8月22日保藏于韩国微生物保藏中心，保藏编号为KCCM10961P。该菌的生长条件为：20～50℃，pH＝6～7.5。本发明使用的微生物，其在好气性条件下，繁殖生长情况良好且对苯酚化合物的分解能力得到改善。本菌株具有优秀的苯酚分解能力，在本发明中得到证实。本发明另一方面提供了一种含有苯酚化合物的废水处理的方法。附图说明图1在600nm波长时测定的吸光度结果：样品浓度分别是苯酚500ppm，250ppm，50ppm时成长的莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株的结果(备注-ppm：百万分率，1ppm＝1mg/L)。图2含有样品苯酚500ppm，250ppm，50ppm的培养基在40℃培养而使莫哈韦芽孢杆菌KJS-3生长，这个培养液各个浓度稀释后莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株在培养皿中生长情况。图3含有样品苯酚1000ppm，2000ppm，3000ppm的培养基在40℃培养而使莫哈韦芽孢杆菌KJS-3生长，这个培养液各个浓度稀释后莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株在培养皿中生长情况。图4含有样品苯酚1000ppm，2000ppm，3000ppm的培养基在25℃培养而使莫哈韦芽孢杆菌KJS-3生长，这个培养液各个浓度稀释后莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株在培养皿中生长情况，但样品苯酚3,000ppm在稀释100,000倍时菌株的成长状态无法确认。具体实施方式下面对本发明进行具体阐述说明，本发明不只局限于所列举的实例应用。实施例1菌株的分离食物垃圾中霉菌无法生长的粘性物质部分采集出来，移到实验室中，在胰胨大豆琼脂培养基(TSA)中于37℃、16小时的条件下摇床中培养.在这里选择出生长的菌落，各自接种于胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中进行保管，将生长的菌株分别保管于45℃和20℃中进行培养，再将这其中培养生长出来的菌株进行选择后再保管.将这些选择保管的菌株在4℃中保管30天，再将这个再次在37℃条件下，胰胨大豆琼脂液态培养基(TSA)中培养.在10种的培养液中37℃条件下培养7天且有内生孢子(Endospore)形成的其中2个菌株选择出来，分别将菌株命名为3号和4号菌株。这些菌株分别委托韩国微生物保藏中心进行遗传物质分析后得到莫哈韦芽孢杆菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)和莫哈韦芽孢杆菌KJS-4(BacillusmojavensisKJS-4)菌株，并进行了菌株菌种登记。莫哈韦芽孢杆菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)在韩国微生物保藏中心BacillusmojavensisKJS-3(保藏编号：KCCM10961P)进行保藏。实施例2具有苯酚分解能力的确认上述的2种微生物莫哈韦芽孢杆菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)和莫哈韦芽孢杆菌KJS-4(BacillusmojavensisKJS-4)在温度40℃中，胰胨大豆琼脂培养基(TSA)中接种培养.使用在40℃中培养的莫哈韦芽孢杆菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)进行本实验。1，莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株在10mlTSB培养基中接种，40℃、培养16小时以上。培养16小时后的培养液中取5ml出来，在100mlTSB中接种，在40℃温度条件下培养90分钟，搅拌速度保持为100～200rpm即可。2，上述步骤中培养的培养物取500μl(微升)在10,000rpm、1分钟的条件下离心分离且除去上层清液，再注入500μl的生理盐水(0.9％NaCl)，完全地混合后接种于最少培养基中。3，根据不同的时间，在0min，30min，60min，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时和8小时以后，紫外可见分光光度仪中测定吸光度(O.D)值，确定菌株的生长曲线。最少培养基的组成如下：(1升，pH7.0)NH4Cl1.0g，K2HPO44.35g，NaH2PO43.9g，MgSO4.7H2O0.48gCaCl20.03g，FeSO40.01g，MnCl20.01g，CoCl20.001g，Na2MnO40.001g。制作3个最少培养基，分别地以苯酚的浓度为50ppm，250ppm，500ppm进行制作和试验，吸光度在600nm波长下测定如下：50ppmphenol250ppmphenol500ppmphenol0min0.0320.0320.03230min0.0570.070.0661hr0.0740.0760.0942hrs0.1140.1300.1613hrs0.1500.1810.1934hrs0.3120.3310.3175hrs0.5190.5240.5396hrs0.7210.6870.6887hrs0.7540.7040.7358hrs0.7310.7050.691从上述结果中可知，莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株以苯酚作为碳元素分解利用，7小时后呈最大生长状态，参照图1。实施例3针对苯酚分解菌株的苯酚含量测定，按照下面顺序进行反应实验，在波长650nm进行吸光度测定。1)菌株在培养8小时后，将培养液转至冰箱保管备用。2)苯酚定量(1)标准品制备：250ppm-苯酚，25ppm-苯酚，12.5ppm-苯酚。(2)样品：500ppm-苯酚，包含少量培养基(在40℃、培养8小时)；250ppm-苯酚包含少量培养基，50ppm-苯酚包含少量培养基(在40℃、培养8小时)。(3)实验过程：标准品和各个样品分别各取100ml，加6ml的8wt％K3Fe(CN)6、6ml的0.1MFeCl3(0.1MHCl作溶剂)之后，反应5分钟后，在波长650nm处测定吸光度值(OD)。结果如下表所示：从上表可知，样品500ppm中的OD值为1.304，约有17ppm的苯酚被检测出，说明其500ppm中483ppm的苯酚被分解，而且样品250ppm中的OD值为1.108，约有14ppm的苯酚被检出，说明250ppm中236ppm的苯酚被分解，最后在样品50ppm中的OD值为1.084，说明约有13ppm的苯酚被检出，37ppm的苯酚被分解，所以，本发明中莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株针对苯酚化合物的分解能力优秀的特点被证实。实施例4实施例2中培养的莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株进行分阶段的稀释，确认其菌株状况。以102，104，105，106浓度进行稀释，各自取0.5ml后，在胰胨大豆琼脂培养基(TSA)上均匀地铺展开进行培养，直径为90mm的培养皿中选择菌落数从30个至不到300个，并与原来培养的培养基中的菌浓度作比较。图2中可知，含有500ppm的苯酚培养基中有103个菌落，稀释倍数为105，原来培养基中属于2×107cfu/ml的菌株。含有250ppm的苯酚的培养基中有37个菌落，稀释倍数为105，这是原来培养基为8×106cfu/ml浓度的菌株。含有25ppm的苯酚的培养基中有32个菌落，稀释倍数为105，这是原来培养基为6×106cfu/ml浓度的菌株。从这个结果可以看出，莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株在苯酚含量为500ppm为止，生长状态良好，而且对50ppm，250ppm，500ppm做个比较的话，500ppm中菌数增加最多，在最少培养基中，苯酚为唯一碳源，莫哈韦芽孢杆菌KJS-3也可分解利用并正常生长。实施例5莫哈韦芽孢杆菌KJS-3菌株在TSB培养基中，过夜培养，含有苯酚的6个最少培养基准备接种，其中3个培养基在25℃条件下培养，另3个培养基在40℃条件下培养，这时，各个温度的含有苯酚的浓度为1,000ppm，2,000ppm，3,000ppm，16小时培养后，稀释105或106倍并取0.5ml在胰胨大豆琼脂培养基(TSA)上均匀地平铺开进行培养，直径为90mm的培养基TSA中生长的菌数进行确认。图3中可知，在40℃条件下含有1,000ppm苯酚的1,000,000倍稀释培养基中，菌数分别为65个、49个，这与原来培养基1.2×108cfu/ml相关的菌数相比属于相当高的水准，但是含有2,000ppm和3,000ppm苯酚的100,000倍稀释培养基中，菌数为5个、13个，虽然可以分解利用苯酚，但可以看出出现生长抑制的状况，所以，莫哈韦芽孢杆菌KJS-3在温度为40℃时，1,000ppm的含有苯酚的培养基中可以生长。图4中可以看出，在25℃条件下，含有1,000ppm的苯酚的100,000倍稀释培养基中菌落为98个，原来培养基2×106cfu/ml浓度的菌数。但是含有2,000ppm苯酚的100,000倍稀释培养基中，检出菌数为11个、13个，虽然可以分解利用苯酚但可以看出出现生长抑制现象，而且含有3,000ppm苯酚的100,000倍稀释培养基中，菌数基本没有检出，只有1～2个检出，出现对其很强的生长抑制现象。所以，莫哈韦芽孢杆菌KJS-3在温度25℃时含有1,000ppm苯酚的培养基中也可以生长，但是与在40℃相比，生长速度有所下降。当前第1页1 2 3