专利名称：一种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，具体地讲涉及一种甲基睾 酮分子印迹聚合物的悬浮聚合制备方法。
背景技术：
甲基睾酮是一种人工合成的代谢类固醇，作为一种促生长剂，上个世纪一直广泛 应用于畜牧业与水产中。但是由于甲基睾酮代谢缓慢，蓄积性强，通过食物链进入人体，会 产生严重的副作用，诸如肝中毒，胎体中毒、致癌等。欧盟早在1988年就开始禁止使用类 固醇激素诸如甲基睾酮来饲养家畜。而在我国，从1999年起也已经法令禁止使用甲基睾酮 作为促生长剂。但是到目前为止，仍有少数企业在违规使用。要彻底避免这种情况的发生， 除了从源头上控制兽药的生产和使用之外，及时准确地检测和有效富集畜禽产品中兽药残 留一直以来都是研究热点。分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology)的迅速发展始于上世纪90 年代，用于制备具有高亲和性和选择性的可以识别和结合目标分子的特定受体，即分子印 迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)。由于孔穴对模板分子的记忆功能， MIPs对模板分子的亲和力大大增强，表现出分子识别的能力。MIPs依靠形状、大小和化学 功能基的分布对模板分子进行识别，类似于生物体系中酶对底物、抗体对抗原、受体对激素 的作用，具有专一选择性。而且分子印迹聚合物具有制备简单、成本低廉、使用寿命长等优 点，、且比天然的生物分子具有更强的稳定性、更良好的机械性能和高度的交联性。更重要 的是，对于那些天然受体不存在或难以得到的目标分子，用这种方法都可以量身定做。到目 前为止，有机小分子包括药物分子、杀虫剂、氨基酸、肽、核苷酸碱基、留族化合物及糖等的 印迹已经取得成功；金属和其他离子也可用作模板以使功能基具有特定的排布；而体积较 大的分子如蛋白质、细胞等的印迹也已经有报道。可以应用到分子印迹技术中的目标分子 非常多，这也是其发展如此迅速的原因之一。分子印迹聚合物以其优越的分子识别性能被 广泛应用于分离领域，包括高效液相色谱(HPLC)、固相萃取(SPE)、毛细管电色谱(CEC)以 及生物传感器、模拟抗体、模拟酶等方面，其识别过程具有预定性、特异性和实用性这三大 特点。而目前市场上的固定相大都不具有特异性，不能够识别特定分子。目前，关于甲基睾酮分子印迹聚合物及其制备方法尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，具有操作简单、 过程容易控制、成本低等优点；克服了所得到聚合物粒径不均勻、损失大等缺点，所得到的 分子印迹聚合物比表面积大，不需要研磨过筛后就可直接使用。为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下—种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例约为6-60ml/mmol致孔剂中，然后与聚合
3单体以1 3-1 8的比例混合，振荡0.5-4h;其中，致孔剂可以为乙腈、甲醇或丙酮等中 的一种或几种溶液；聚合单体可以为甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AA)或三氟甲基丙烯酸 (TFMAA)等。(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂和引发剂，混合均勻；将分散剂溶于80-100°C 的水中，将该水溶液逐滴加入到上述混合溶液中，通入惰性气体，可以是N2或Ar，通气时间 为10-20min，以去除O2等含氧气体，密封置于55_65°C的水浴，同时搅拌18_30h，固液分离， 高速离心后取其固相部分；其中，交联剂可以为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三甲氧基丙烷三 甲基丙烯酸酯中的一种或其混合物，交联剂与甲基睾酮比例为1 10-1 30;引发剂可 以是偶氮二异丁腈(AIBN)或偶氮二异庚腈(ABVN)，引发剂与甲基睾酮比例为40-100mg/ mmol ；分散剂可以是聚乙烯醇或聚苯乙烯中的一种或其混合物，分散剂与甲基睾酮比例为 l_5g/mmolο(3)步骤(2)中固相部分经酸性有机溶剂提取以去除甲基睾酮后，再用纯有机溶 剂提取以去除残留的酸性物质，即得产物；其中，酸性有机溶剂可以是甲酸、乙酸或三氟乙 酸中的一种或几种与甲醇的混合溶液；纯有机溶剂可以是甲醇、乙醇、乙腈或丙酮等中的一 种或几种。此处所述纯有机溶剂是指甲醇、乙醇、乙腈或丙酮等本身皆为纯的该物质。所制备的甲基睾酮分子印迹聚合物的物理性能如形貌用扫描电镜(SEM)来进行 表征，经10000倍放大后可以检测出其粒径约为微米级；其孔结构及比表面积用BET氮气吸 附法进行测定；聚合物的结合位点性能用拉曼光谱和红外光谱进行分析。孔结构表征所制备的甲基睾酮分子印迹聚合物的比表面积约为300_600m2/g，总 孔体积约为0. 8-1. 5cm7g，孔径约为5-20nm。由分子印迹技术的原理可知，由于在聚合过程 中模板分子的存在，所合成印迹聚合物中的孔穴是与模板分子的功能基团相互补且有特定 的空间构型，具有较强的吸附能力和较大的容量，因此强化了分子印迹聚合物的结合性能。拉曼光谱分析将Detector中的工作温度设为-70 °C，Laser设定为633nm， 衰减设为_(即不衰减)，光栅孔径设定为20 μ m，光栅中心位置为OcnT1，采集范围为 200-lOOOcnT1，使用单晶硅标准样品进行零点校正。然后将光栅孔径设为200 μ m，光栅中心 位置为SOOcnT1，其余参数设置同上，采用相同步骤后观察单晶硅的峰是否稳定在520左右， 调节参数直至达到要求，则完成波数校正。将采集范围设定为OlOOOcnT1，其它参数设定同 波数校正，用同样的方法聚焦后，开启采集功能，进行分子印迹聚合物的拉曼光谱图测定， 等采集过程自动完成后即可得到分子印迹聚合物的拉曼光谱图。通过拉曼光谱分析，加入 模板分子并没有影响聚合反应的发生，分子印迹聚合物与空白聚合物在聚合过程中成键方 式上没有区别，模板分子可以通过溶剂而除去。红外光谱分析红外光谱(infrared spectra)，以波长或波数为横坐标，以强度或 其他随波长变化的性质为纵坐标，所得到的反映红外射线与物质相互作用的谱图。分别取 微量未去模板与去除模板的甲基睾酮分子印迹聚合物，与事先充分干燥的分析纯KBr，用玛 瑙研钵研磨至2 μ m，在专用压片机中，压制成均勻透明的圆形薄片，放入红外光谱仪测定。 结果证明，模板分子并没有影响聚合反应的发生，模板分子的官能团并没有参与成键。分子 印迹聚合物与空白聚合物从组成上来讲是同一种物质。所述甲基睾酮分子印迹聚合物对模板分子及结构类似物的结合作用通过平衡吸 附实验来进行评价。首先配制不同浓度的甲基睾酮溶液，分别加入一定量的分子印迹聚合物进行结合研究，得到结合量随浓度的变化曲线后用Scatchard方程可以计算出最大结合 量Qmax及解离常数Kd，其中Qmax表示结合位点的最大表观结合量，可以表明聚合物的结合能 力，数值越大，结合能力越强；而Kd表示结合位点的平衡离解常数，可以表明聚合物的动力 学性质。具体计算方法如下根据吸附前后溶液浓度的变化计算吸附量及静态吸附分配系数。作Q对C的曲 线·Q = (C1-C2)Vs ‘ 1000/m式中Q——键合容量，μ mol · g—1 ；C1——模板分子的初始浓度，mmol · L—1 ；C2——模板分子的最终浓度，mmol · L—1 ；Vs——实验溶液的体积，ml;m——分子印迹聚合物的质量，mg。由聚合物的结合量绘制出等温吸附曲线，聚合物的Q值随着甲基睾酮浓度的增大 均有不同程度的增大。用于Scatchard 方程Q/C= (Qmax-Q)/Kd式中Q——键合容量，μ mol · g—1 ；C——模板分子的平衡浓度，mmol · L—1 ；Kd——结合位点的平衡离解常数，μ mol · πιΓ1 ；Qmax——结合位点的最大表观结合量，μ mol · g—1。分别计算出甲基睾酮分子印迹聚合物及其空白聚合物的线性回归方程。根据曲线 的斜率和截距求出，所述甲基睾酮分子印迹聚合物的最大结合量Qmax为5-10 μ mol/g，解离 常数 Kd 为 0. 5-1. 0ymol/ml ；所述甲基睾酮分子印迹聚合物对模板分子的选择性能通过以下方法得出将分子 印迹聚合物置于聚四氟乙烯离心管中，分别加入甲基睾酮、丙酸睾酮、17 α-羟孕酮、诺龙、 孕酮、甲孕酮的乙腈溶液，放入振荡器室温下结合，高速离心后取上清液，经滤膜过滤，用高 效液相色谱(HPLC)测定所得溶液中各底物的含量，根据吸附前后溶液浓度的变化可以计 算得出静态吸附分配系数K及识别因子β，据此可以对该分子印迹聚合物的结合性能及选 择性进行评价。其中K表示不同底物在聚合物上的浓度(相当于吸附量)与其在溶液中的 浓度的比值，K值越大，表明聚合物的选择性结合能力越强；而β表示甲基睾酮分子印迹聚 合物的静态分配系数与空白聚合物的静态分配系数的比值，数值越大，表明聚合物的特异 性越强。计算方法如下K = CP/CS式中CP——底物在聚合物上的浓度(相当于吸附量)，μ mol/g ；Cs——底物在溶液中的浓度，mM。β = ΚΜΙρ/ΚΒρ式中，Kmip—甲基睾酮分子印迹聚合物的静态分配系数；Kbp——空白聚合物的静态分配系数。
由上可得，静态吸附分配系数K为4-5，而其他结构类似的K均小于4 ；识别因子β 为5-10，而其他结构类似物的β值均小于2。本发明的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，具有方法简单、过程容易控制等 优点；避免了本体聚合时繁琐的研磨过筛步骤，节约了成本；克服了所得到聚合物粒径不 均勻、损失大等缺点。所得到的分子印迹聚合物比表面积大，具有较高的最大结合量Qmax和 解离常数Kd，因此有良好的结合能力和分离能力；同时其静态吸附分配系数K和识别因子 β也较高，因而有良好的识别能力和选择特性。而且，可以通过调节模板、单体、交联剂以及 致孔剂的配比，对聚合物的颗粒大小进行调控，得到适合不同用途的高分子材料。
图1为本发明的一种甲基睾酮分子印迹聚合物的扫描电镜(SEM)图；图2为本发明的一种甲基睾酮分子印迹聚合物的拉曼光谱图；图3为本发明的一种甲基睾酮分子印迹聚合物的红外光谱图。
具体实施例方式通过下述实施例将有助于理解本发明，但不限制本发明的内容。实施例1一种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例约为60ml/mmOl致孔剂乙腈中，然后与聚 合单体甲基丙烯酸(MAA)以1 3的比例混合，振荡2h;(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异 丁腈(AIBN)，混合均勻；将分散剂聚乙烯醇溶于80°C的水中，将该水溶液逐滴加入到上述 混合溶液中，通入N2IOmin,以去除O2，密封置于60°C的水浴，同时搅拌18h，固液分离，高速 离心后取其固相部分；其中，交联剂与甲基睾酮比例为1 20，引发剂与甲基睾酮比例为 70mg/mmol,分散剂与甲基睾酮比例为3g/mmol。(3)步骤(2)中固相部分经乙酸与甲醇的混合溶液提取后，再用纯甲醇提取以去 除残留的乙酸，即得产物。所制备的甲基睾酮分子印迹聚合物用扫描电镜来观察，如图1所示，溶剂对多孔 结构的聚合物影响较小，制备多孔结构的聚合物，可以有效防止溶胀现象发生。多孔结构的 骨架交联成复杂的网状，结构较为稳定，溶剂分子无法在多孔结构内部大量存在，也无法使 聚合物膨胀。经孔结构表征，比表面积约为477m2/g，总孔体积约为1. 12cm7g，孔径约为 9. 24nm。称取20mg的甲基睾酮分子印迹聚合物于聚四氟乙烯离心管中，分别加入5mL不同 浓度的甲基睾酮乙腈溶液，放入振荡器中室温下震荡12h，10000r/min下离心20min，取上 清液，经0. 45 μ m滤膜过滤，用HPLC测定所得溶液中甲基睾酮的含量，根据吸附前后溶液浓 度的变化计算得出该分子印迹聚合物的最大吸附量Qmax和平衡离解常数Kd的值分别为10 和 0. 8。将该分子印迹聚合物置于聚四氟乙烯离心管中，分别加入5ml浓度为1. 00mmol/L的甲基睾酮、丙酸睾酮、17 α-羟孕酮、诺龙、孕酮、甲孕酮的乙腈溶液，放入振荡器室温下结 合12h，10000r/min下离心20min，取上清液，经0. 45 μ m滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC) 测定所得溶液中各底物的含量，根据吸附前后溶液浓度的变化可以计算得出静态吸附分配 系数K为5，识别因子β为7. 8，均大于其它结构类似物。如图2拉曼光谱所示，a谱图代表未去模板的分子印迹聚合物；b谱图代表已去模 板的分子印迹聚合物，a谱图在1600cm-1处与b存在差异，原因在于a谱图是未去模板分子 的分子印迹聚合物，聚合物中存在着未除去的甲基睾酮。这表明，加入模板分子并没有影响 聚合反应的发生，分子印迹聚合物与空白聚合物在聚合过程中成键方式上没有区别，模板 分子并没有参与聚合反应，可以通过溶剂而除去。如图3红外光谱所示，a谱图代表未去模板的分子印迹聚合物；b谱图代表已去模 板的分子印迹聚合物；a和b谱图在2900CHT1附近存在差异，在ZgeOcn^dSTOcnT1出现的是 甲基的特征峰，原因在于a谱图是未去模板分子的分子印迹聚合物，聚合物中存在着未除 去的甲基睾酮，而甲基睾酮中的甲基为参加聚合反应，被完整保留。这现象进一步说明，模 板分子并没有影响聚合反应的发生，模板分子的官能团并没有参与成键。分子印迹聚合物 与空白聚合物从组成上来讲是同一种物质。实施例2(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例约为6ml/mmol致孔剂甲醇中，然后与聚合 单体丙烯酰胺(AA)以1 8的比例混合，振荡4h ；(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮 二异庚腈(ABVN)，混合均勻；将分散剂聚苯乙烯溶于100°C的水中，将该水溶液逐滴加入到 上述混合溶液中，通入氩气lOmin，以去除O2等含氧气体，密封置于55°C的水浴，同时搅拌 24h，固液分离，高速离心后取其固相部分；其中，交联剂与甲基睾酮比例为1 30，引发剂 与甲基睾酮比例为40mg/mmol，分散剂与甲基睾酮比例为5g/mmol。(3)步骤(2)中固相部分经三氟乙酸与甲醇的混合溶液提取后，再用纯乙醇提取 以去除残留的三氟乙酸，即得产物。经孔结构表征，比表面积约为605m2/g，总孔体积约为1. 5cm3/g,孔径约为15nm。分子印迹聚合物的最大吸附量Qmax和平衡离解常数Kd的值分别为5和1. 0，测定 和计算方法同实施例1。该分子印迹聚合物的静态吸附分配系数K为4，识别因子β为10，测定和计算方 法同实施例1。实施例3(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例约为30ml/mmol致孔剂丙酮中，然后与聚 合单体三氟甲基丙烯酸(TFMAA)以1 5的比例混合，振荡0.5h;(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂和引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，混合均勻；将 分散剂聚苯乙烯溶于90°C的水中，将该水溶液逐滴加入到上述混合溶液中，通入N2IOmin, 以去除O2等含氧气体，密封置于65°C的水浴，同时搅拌30h，固液分离，高速离心后取其固 相部分；其中，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯与三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯的混合物， 交联剂与甲基睾酮比例为1 10，引发剂与甲基睾酮比例为lOOmg/mmol，分散剂与甲基睾 酮比例为lg/mmol。
(3)步骤(2)中固相部分经甲酸与甲醇的混合溶液提取后，再用纯乙腈提取以去 除残留的乙酸，即得产物。经孔结构表征，比表面积约为299m2/g，总孔体积约为0. 8cm3/g,孔径约为20nm。分子印迹聚合物的最大吸附量Qmax和平衡离解常数Kd的值分别为8和0. 5，测定 和计算方法同实施例1。该分子印迹聚合物的静态吸附分配系数K为4.5，识别因子β为5，测定和计算方 法同实施例1。实施例4(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例约为50ml/mmol致孔剂丙酮中，然后与聚 合单体甲基丙烯酸(MAA)以1 5的比例混合，振荡1. 5h ；(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁 腈(AIBN)，混合均勻；将分散剂聚苯乙烯溶于90°C的水中，将该水溶液逐滴加入到上述混 合溶液中，通ΛΝ215π η，以去除O2等含氧气体，密封置于65°C的水浴，同时搅拌30h，固液 分离，高速离心后取其固相部分；其中，交联剂与甲基睾酮比例为1 10，引发剂与甲基睾 酮比例为lOOmg/mmol，分散剂与甲基睾酮比例为lg/mmol。(3)步骤(2)中固相部分经乙酸与甲醇的混合溶液提取后，再用纯丙酮提取以去 除残留的乙酸，即得产物。经孔结构表征，比表面积约为434m2/g，总孔体积约为1. lcm3/g,孔径约为5nm。分子印迹聚合物的最大吸附量Qmax和平衡离解常数Kd的值分别为7和0. 68，测定 和计算方法同实施例1。该分子印迹聚合物的静态吸附分配系数K为4.3，识别因子β为6.9，测定和计算 方法同实施例1。实施例5(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例约为50ml/mmol致孔剂丙酮中，然后与聚 合单体甲基丙烯酸(MAA)以1 5的比例混合，振荡4h;(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁 腈(AIBN)，混合均勻；将分散剂聚苯乙烯溶于90°C的水中，将该水溶液逐滴加入到上述混 合溶液中，通入N220min，以去除O2等含氧气体，密封置于65°C的水浴，同时搅拌20h，固液 分离，高速离心后取其固相部分；其中，交联剂与甲基睾酮比例为1 20，引发剂与甲基睾 酮比例为70mg/mmol，分散剂与甲基睾酮比例为3g/mmol。(3)步骤(2)中固相部分经乙酸与甲醇的混合溶液提取后，再用纯丙酮提取以去 除残留的乙酸，即得产物。经孔结构表征，比表面积约为520m2/g，总孔体积约为1. 2cm3/g,孔径约为18nm。分子印迹聚合物的最大吸附量Qmax和平衡离解常数Kd的值分别为9和0. 95，测定 和计算方法同实施例1。该分子印迹聚合物的静态吸附分配系数K为4.8，识别因子β为9.2，测定和计算 方法同实施例1。
权利要求
一种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将模板分子甲基睾酮溶于与其比例为6 60ml/mmol致孔剂中，然后与聚合单体以1∶3 1∶8的比例混合，振荡0.5 4h；(2)在步骤(1)的产物中加入交联剂和引发剂，混合均匀，将分散剂的水溶液逐滴加入到上述混合溶液中，通入惰性气体10 20min，密封置于55 65℃的水浴，同时搅拌18 30h，固液分离，取其固相部分；(3)步骤(2)中固相部分经酸性有机溶剂提取后，再用纯有机溶剂提取，即得产物；其中，步骤(2)中交联剂与甲基睾酮比例为1∶10 1∶30，引发剂与甲基睾酮比例为40 100mg/mmol，分散剂与甲基睾酮比例为1 5g/mmol。
2.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中致孔剂为乙腈、甲醇或丙酮中一种或几种的溶液。
3.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述聚合 单体为甲基丙烯酸、丙烯酰胺或三氟甲基丙烯酸。
4.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种或其混合 物。
5.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤 ⑵中引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)或偶氮二异庚腈(ABVN)。
6.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤 (2)中分散剂为聚乙烯醇或聚苯乙烯中的一种或其混合物。
7.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤 (2)中惰性气体为N2或Ar。
8.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中分散剂溶液的制备方法为将分散剂溶于80-100°C的水中。
9.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的酸性有机溶剂为甲酸、乙酸或三氟乙酸中的一种或几种与甲醇的混合溶液。
10.根据权利要求1所述的甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述步 骤(3)中纯有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种甲基睾酮分子印迹聚合物的制备方法，该制备方法为将甲基睾酮溶于与其比例为6-60ml/mmol致孔剂中，然后与聚合单体以1∶3-1∶8的比例混合，振荡0.5-4h；加入交联剂和引发剂，混合均匀，将分散剂的水溶液逐滴加入到上述混合溶液中，通入惰性气体10-20min，密封置于55-65℃的水浴，同时搅拌18-30h，固液分离，取其固相部分；经酸性有机溶剂提取后，再用纯有机溶剂提取，即得产物。本发明所涉及的方法具有操作简单、过程容易控制、成本低等优点；克服了所得到聚合物粒径不均匀、损失大等缺点，所得到的分子印迹聚合物比表面积大，不需要研磨过筛后就可直接使用。
文档编号B01J20/26GK101942056SQ20101027958
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者储晓刚, 杨敏莉, 沈蕊莲, 王大宁 申请人:中国检验检疫科学研究院