专利名称：鱼露中章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品检测方法，具体涉及一种鱼露中肾上腺素能受体激动剂章 鱼胺及其前体化合物酪胺含量的高效液相色谱检测方法。
背景技术：
章鱼胺，作为一种重要的生物胺与神经介质，有广泛的生理作用，其中之一是
作为内源性的e 3—肾上腺素能受体激动剂，它在能量的平衡和代谢调节上起着重 要作用，也是目前唯一作为产品的防治肥胖症与糖尿病的e3-肾上腺素能受体激动 剂。中药枳实和食品鱼露是天然章鱼胺的主要来源，但枳实中章鱼胺的含量仅为
0.01 0.03%，而鱼露中含有相对丰富的章鱼胺，因而，进一步改进鱼露的发酵工
艺，从鱼露中提取章鱼胺，提升鱼露加工产业的效益，是海洋药物研究的一个新领 域。
鱼露中章鱼胺的检测，早期采用鱼露碱化处理后用乙醚提取，气相色谱测定的
方法， Mclver RC, Brooks RI， Reineccius GA. Flavor of fermented fish sauce. [J] .J. Agric. Food Chem, 1982， 30: 1017-1019。由于章鱼胺在乙醚中的溶解度 有限，研究中发现该方法仅可以用于定性，而定量则数值偏低。目前，当生物胺采 用HPLC测定时， 一般是对生物胺进行化学衍生处理，但此操作过程繁琐，成本高， 见李志军吴永宁薛长湖.食品中多种生物胺同时检测方法研究进展[J].卫生研究， 2006， 35(5):670-674报道。由于鱼露含有27%的氯化钠，成分复杂，用上述化学 衍生方法不完全适合鱼露中章鱼胺的测定，因此研究新的适用于鱼露的、通用的、 不需化学衍生处理的章鱼胺的HPLC分析方法具有重要的意义。2004年，Pellat报
3道了不经衍生处理在220nm检测枳实中章鱼胺的HPLC的方法,Pellati F， Benvenuti S，Melegari M,High-performance liquid chromatography methods for the Analysis of adrenergic amines and flavanones in citrus aurantium var amara [J]， Phytochemical Analysis, 2004,15: 220-225.但该方法流动相在220nm处有 吸收，对检测数据有干扰，不能精确测定。酪胺是章鱼胺的前体化合物，研究新的 适用于章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法尤其重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用HPLC检测方法 测定章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的方法。
本发明对鱼露中章鱼胺含量测定方法进行了研究，本发明经用紫外分光光度仪 对章鱼胺及其前体化合物酪胺标准品溶液进行扫描，均具有相同的最大吸收波长 274nm，且不受pH、生物胺浓度及含盐量的影响，故选择274nm作为检测波长。本 研究以相关物质在紫外波段内的吸收峰的研究为基础，在检测波长274nm对鱼露中 的章鱼胺及酪胺进行了 HPLC分析方法的研究，提供了一种快速的不需要衍生处理 的HPLC检测方法。
本发明人进行了下列基础试验
实验条件
色谱柱phe醒enex l腿C18(150X4. 60mm， 5um)。
流动相0.02mol *L—l柠檬酸一0.02mol *L—l磷酸二氢钠(7: 3)， pH调为 3，流速1.0mL*min-1，紫外检测波长274nrn,进样体积10uL。 实验内容
紫外检测波长的确定分别取章鱼胺标准品适量，用流动相配制成浓度分别为 250ug 'mL—1， 125ug ml/1, 62.5ug ml/1的三种标准品溶液，按照分光光度法，在200—300nm波长范围内用分光光度计进行扫描，结果三种浓度的章鱼胺溶液 最大吸收峰都在274nm处(图l)，不受pH与浓度的影响，而流动相在220nm处有吸收。 酪胺在274nm处也有最大吸收。因此用HPLC检测时选择274nm作为章鱼胺及其前体化 合物酪胺的检测波长。
线性关系将浓度为50ug mL-l的章鱼胺和酪胺标准品，加流动相稀释成O， 10， 20， 30， 40， 50ii g mL-l的梯度溶液，按色谱条件检测，以峰面积Y与浓 度X做标准曲线。经回归分析，章鱼胺在0.0057 50ixg ，mL-l范围内有良好的线性 关系，回归方程为Y二2868. 4X+60. 619， r=0.9991，酪胺在O. 025 50 u g mL-l范围 内有良好的线性关系，回归方程为Y-3008.2X+449. 1， r=0.9995。
最小检测浓度分别取章鱼胺和酪胺标准品溶液，进样10uL，记录色谱图。当 色谱峰的峰高为噪音的3倍时(s/『3)，章鱼胺和酪胺的浓度为最小检测浓度，分别 为5.7ng mL-l和25ng mL-1。符合痕量测定的要求。
精密度取50ug raL-l的章鱼胺标准品溶液连续进样6次，在上述色谱条 件下测定，章鱼胺峰面积的平均值为145795， RSD=1.8%，表明仪器精密度良好。
稳定性鱼露用流动相稀释100倍，然后经微孔滤膜(0.45um)滤过，间隔一定 时间进样，测定。RSD=1.63%。结果表明，章鱼胺在24h内基本稳定。
重现性精密量取5份同一批次样品1.0mL，用流动相稀释100倍，制成5份样品 溶液，进样测定，RSD=1.51% 。表明本方法重现性良好。
加样回收率将已知含量的分析试样、溶液取等量三份，加入不同量的章鱼胺标 准品溶液，用流动相配成一系列不同浓度的溶液，进样10uL，测定回收率，平均 加样回收率为104.4%。
经过上述试验，确定了用HPLC的检测方法。
本发明提供了一种鱼露中章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法。 该方法采用HPLC方法，包括下列步骤
5(1) 标准溶液的制备精密称取章鱼胺和酪胺标准品，分别用流动相配成浓度 为50"g'mL-1的溶液，然后将两种溶液等体积混合，微孔滤膜(0.45um)过滤， 成为章鱼胺和酪胺的混合标准品溶液；
(2) 样品溶液的制备鱼露用流动相稀释100倍，微孔滤膜(0.45um)过滤；
(3) 检测采用phenomenex luna C18(150X4. 60腦，5um)色谱柱，流动相 为0.02mo1'L—l柠檬酸一0.02mo1'L—1磷酸二氢钠(7: 3) (v/v) ， pH调至3， 流速1.0mL，min-1，紫外检测波长274nm，混合标准品溶液进样10u L,记录色谱 图(图2);
样品溶液进样10uL，记录峰面积，以外标法计算样品百分含量。(鍉鱼鱼露样 品色谱图如图3所示)。
本发明方法样品用量少，可直接上机测定，具有良好的专一性，精密度和回收 率。实验结果表明，测定结果稳定，具有微量、简便、快捷、灵敏等特点，能符合 痕量测定的要求。
图1三种浓度的章鱼胺标准溶液在200—300nm波长范围内紫外扫描色谱图。 图2章鱼胺和酪胺混合标准溶液在274nm的HPLC色谱图。 图3鍉鱼鱼露样品在274nm的HPLC色谱图。
具体实施例方式
实例l
鍉鱼鱼露和七星鱼鱼露的检测
鍉鱼鱼露和七星鱼鱼露用流动相稀释100倍，微孔滤膜(0.45um)过滤，备用； 采用phenomenex lunaC18(150X4. 60mm， 5um)色谱柱，流动相为0. 02mol L—l柠檬酸—0.02mol L—1磷酸二氢钠(7: 3)， pH调至3，流速1. OmL min-l， 紫外检测波长274nm，样品溶液进样10nL，记录峰面积(表1)，以外标法计算样 品百分含量。
表l HPLC测定所得标准品和样品溶液的峰面积
混合标准品溶液鍉鱼鱼露七星鱼鱼露
章鱼胺656942772314873
酪胺689007099545253
已知混合标准溶液中章鱼胺和酪胺浓度均为25ix g mL-l，根据外标法可以得 出，鍉鱼鱼露中含章鱼胺1055ug mL—、酪胺2576ug mL—、七星鱼露中含章 鱼胺566ug mL—'，酪胺1642ug mL一1。 (鍉鱼鱼露样品色谱图如图3所示)。
权利要求
1、一种鱼露中章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)标准溶液的制备精密称取章鱼胺和酪胺标准品，分别用流动相配成浓度为50μg·mL-1的溶液，然后将两种溶液等体积混合，微孔滤膜0.45μm过滤，成为章鱼胺和酪胺的混合标准品溶液；(2)样品溶液的制备鱼露用流动相稀释100倍，微孔滤膜0.45μm过滤；(3)检测采用phenomenex luna C18 150×4.60mm，5μm色谱柱，流动相为0.02mol·L—1柠檬酸—0.02mol·L—1磷酸二氢钠73v/v，pH调至3，流速1.0mL·min-1，紫外检测波长274nm，混合标准品溶液进样10μL，记录色谱图；样品溶液进样10μL，记录峰面积，以外标法计算样品百分含量。
全文摘要
本发明提供了一种鱼露中章鱼胺及其前体化合物酪胺含量的检测方法。该方法采用HPLC方法，本发明方法样品用量少，可直接上机测定，具有良好的专一性，精密度和回收实验结果表明，测定结果稳定，具有微量、简便、快捷、灵敏等特点，能符合痕量测定的要求。
文档编号G01N33/48GK101464455SQ20071017254
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者曲映红, 朱婷婷, 王建中, 王锡昌, 荣艳萍, 陈舜胜 申请人:上海水产大学