专利名称：花鳗鲡生长激素及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水产学基因工程技术领域，特别涉及一种花鳗鲡生长激素及其编码基因和应用。
背景技术：
生长激素(Growth hormone, GH)是包括鱼类在内的所有脊椎动物脑垂体分泌的一种单链多肽激素。GH是一种具有广泛生理功能的生长调节素，能影响几乎所有的组织类型和细胞，包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要生理作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖和脂肪的代谢。GH发挥作用主要通过两种方式一是诱导肝细胞等产生GH介质(又称胰岛素样生长因子，IGFs)，再由IGFs间接起作用；二是直接作用于靶细胞产生生理效应。无论哪一种方式GH都需要首先与GH结合蛋白结合，通过GH结合蛋白与细 胞表面特异性受体结合，再由受体介导产生生物效应。目前对GH的研究主要集中于鸟类和哺乳类，近年来对鱼类的研究也日趋增多。GH能增强食欲、提高饲料转化率、加速鱼体生长发育，被认为是最有效的促进生长因子。然而，鱼类体内天然激素含量极低，分离纯化比较困难，成本较高，不可能大规模应用于生产。近年来，基因工程技术的飞速发展和完善为大量生产廉价的鱼类激素提供了保证。生长激素在水产养殖业有重大作用，越来越得到人们的重视。鱼类生长激素基因的克隆及表达无论在科学研究还是生产应用上都有重要意义。花鳗鲡在分类学上隶属于硬骨鱼纲、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属，广泛分布于全球热带、亚热带和温带地区，是鳗鲡属鱼类中分布最广的种类。我国的福建、广东、台湾、海南等省的河流海域可见到花鳗鲡，但由于人为捕捞严重及江河中修建水利水电工程对河道的破坏，花鳗鲡的自然资源显著下降，已被列为我国二级保护动物。花鳗鲡品味鲜美，其肉和肝的维生素A含量特别高，营养丰富，具有相当高的营养价值，但价格昂贵，历来被视为上等滋补食品，称之为“水中人参”。近年来，在我国养殖花鳗鲡已经逐步形成规模化，但是花鳗鲡的养殖者普遍认为该鱼野性大，驯化难，低龄阶段不易长大；逃走能力特别强，可以跳跃式逃走；养殖过程中苗种生长速度是制约其发展的主要原因。在工厂化养殖花鳗鲡的生产周期中，II龄前苗种的生长速度较慢，II龄后生长速度才显著提高，这种现象一直困扰养殖户及企业。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种花鳗鲡生长激素。本发明的另一目的在于提供上述花鳗鲡生长激素的编码基因。本发明的再一目的在于提供所述的花鳗鲡生长激素的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种花鳗鲡生长激素，其氨基酸序列如SEQN0. I 所示；编码所述的花鳗鲡生长激素的核苷酸序列如SEQN0. 2所示；
所述的花鳗鲡生长激素可应用于花鳗鲡的养殖，特别是花鳗鲡的规模化养殖。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明首次通过对花鳗鲡的GH基因进行克隆、测序及分析，并进行表达获得同源生长激素，将其应用于解决养殖生产中出现的问题，实现产学研结合，为花鳗鲡人工养殖和可持续发展提供新的理论依据。本发明提供的花鳗鲡生长激素有利于大规模的推广应用，具有较好的经济效益。
图I是GH cDNA序列扩增凝胶电泳图，其中M为Marker，1、2为目的片段。图2是琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR结果图，其中编号1-5为菌液鉴定PCR产物;M 为 Marker DL2000。·图3是15wt%SDS_PAGE电泳检测纯化结果图，其中A为Marker，B为空载对照，C为未加IPTG诱导的蛋白，D为总蛋白，E为上清液，F为沉淀物，G为最初洗脱物，H为洗脱液I，I为洗脱液II，J为洗脱液III。图4是同源生长激素浸泡花鳗鲡苗的生长情况比较图。图5是同源生长激素浸泡花鳗鲡苗的增重率比较图。图6是同源生长激素浸泡花鳗鲡苗的特定生长率比较图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(一)花鳗鲡生长激素编码基因根据已知鱼类GH基因的保守序列，设计合成简并引物，采用同源克隆的方法，从花鳗鲡脑垂体基因组DNA中扩增得到GH基因的中间片段；利用已克隆的中间片段，设计特异引物，获得了 GH基因cDNA ;通过序列拼接，最终得到花鳗鲡生长激素编码基因。I、总RNA提取提取花鳗鲡的脑垂体总RNA (提取方法参考Trizol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书)。2、反转录PCR :取上述提取得到的总RNA,使用购自TAKALA公司的Fermentas反转录试剂盒，参考说明书中的操作步骤，进行反转录PCR，获得总cDNA (I)在超净工作台中，取DEPC处理的200μ I PCR管置冰上，依次加入总RNA2y I、引物(O. 5 μ g/ μ I) I μ g、无菌去RNA水10 μ I定容至总体积13 μ I (如表I),轻轻混勻；表I反转录PCR反应体系I
RNA2^
oligo (d'T) η primerI μ Watei'. nuclease-free10μ1 总体积 Μ(2) 65 °C 反应 5min，重新置于冰上，依次加入 5XRT Buffer 4 μ I、RNaseinhibitor (20U/μ I) I μ I 和 IOmM dNTP Mix 2 μ I,混勻，用微量离心机 3000rpm 离心 30s。置PCR仪25°C 5min。取出置冰上冷却。加入M-MuLV逆转录酶(200U/ μ I) I μ I至终体积21 μ I (如表 2)；表2反转录PCR反应体系2
5 X Reaction Buffer4μ!
RNase Inhibitor (20μ/μΠI μ IOmM dNTP Mix2μ1 M-MuLV Reverse Transcriptase (200 U /μΙ) Ιμ
总体积2hli(3)置 PCR 仪中按以下条件进行25°C /10min，42°C /60min，70°C /5min，立即冰上 冷却，产物cDNA即用于PCR，保存于_30°C冰箱中。3、GH基因外显子片段的获取3. I引物的设计参考已报道的日本鳗鲡及欧洲鳗鲡的GH基因序列(登录号分别为M24066. I和AY616666. I)，登录Genebank下载其序列，分析保守区域发现外显子部分高度保守，在外显子序列两端设计一对引物上游引物HMLF :5’ -ATGGCATCAGGGTTCCTTC-3’，下游引物HMLR :5’-CTACAGGGTGCAGTTGCTTTC_3’ ；3. 2PCR 反应依次加入表3反应物表3PCR反应混合体系
cDNA μ
Primer FΟ. μ
Primer R0.1 μ1!丁叫°·1 .u^ dNTP Mix 4.7μ!
QdH2O4μΙ
总体积10μ1PCR 反应程序94 °C 3min, (94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72 °C 40sec) 33 个循环，72°C 8min, 4°C forever ；3. 3PCR产物检测取3. 2PCR反应的PCR扩增产物2份，每份5 μ I，于I. 0wt%琼脂糖凝胶进行电泳检测，Ig琼脂糖加IOOml蒸馏水，微波炉煮沸熔化后，冷却至60°C，加入溴化乙啶(EB，IOmg/ml)5l·! I ;电压150V、时间为15min ;电泳结束后，用凝胶成像系统拍照并保存(图I);由图I可以看到，PCR扩增产物的目的条带清晰、大小约630bp。3. 4目的片段的回收纯化
(I)紫外透照仪下观察凝胶取3. 3电泳结束后的琼脂糖凝胶，从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶(尽量减少在紫外下曝光时间)，切碎凝胶块，称重，计算凝胶块体积(Img 约 I μ I);(2)向凝胶块中加入等体积的Binding Buffer,没过凝胶块为宜,置于60°C烘箱中，每隔2min摇勻一次,溶胶8min,得到溶胶；(3)向HiBind DNA柱中加入700 μ I步骤(2)的溶胶，lOOOOrpm、室温离心Imin ；(4)弃废液，加 300 μ I Binding Buffer (XP2), lOOOOrpm、室温离心 Imin ;(5)弃废液，加入 700 μ I SPff Wash Buffer 溶液，lOOOOrpm、室温离心 Imin ；(6)重复步骤(5);
(7)弃废液，13000rpm、室温离心 2min ；(8)换一只新的 EP 管，向 HiBind DNA 柱中加入 30μ1 Elution Buffer, 13000rpm>室温离心Imin ；(9)将离心后的溶液重新加入HiBind DNA柱中，13000rpm、室温离心lmin，所得沉淀为PCR目的片段；3. 5PCR产物的克隆测序将步骤3. 4回收的PCR目的片段与PMD18-T载体重组连接依次加入I μ 1PMD18-TVector>5 μ I Ligation Solution I、I μ I 步骤 3. 4 回收的 PCR 产物,加纯净水补至 10 μ I,轻柔离心混匀(3000rpm、室温离心2min)，置于酶连仪上16°C连接15h，4°C保存。3. 6连接产物的转化(I)取5μ1步骤3.5的连接产物，加入2(^1未完全解冻的大肠杆菌0册0感受态细胞，轻轻混勻，3000rpm、室温离心2min,冰中放置30min ；(2) 42°C热激90s后冰浴2min，得混合物；(3)将步骤(2)的混合物加入到800μ I LB培养基中，37°C、220rpm振荡培养Ih ；(4)室温2000rpm离心2min，吸掉400 μ I上清液后吹打混匀，得到混合液；(5)取100 μ I步骤(4)的混合液均匀涂布在含LA培养基的平板中，于37°C培养Ih后，倒置培养过夜；3. 7重组质粒的筛选及保种(I)挑取3. 6步骤(5)的平板LA培养基上单个白色菌落置于含IXf5Amp的800 μ ILB培养基中，37°C、200rpm振荡培养3h，得菌液；(2)菌液PCR鉴定向0. 2ml PCR管中依次加入I μ I步骤(I)的菌液、5 μ IMix、
0.I μ I M13F (10μΜ)、0· I μ 1M13R (10 μ Μ)和 O. 1μ I Taq 酶，加纯净水补至 50 μ 1，瞬时离心混勻，3000rpm、室温离心30s ；(3) PCR 反应程序94°C变性 3min ;94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，33个循环，72°C后延伸8min，16°C保存；(4)琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR结果对菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，记录阳性克隆的编号，结果见图2 ;从图2中可见PCR产物(1-5)单克隆的条带大小都在800bp左右，大小均符合测序要求，3为空载体；(5)超净工作台中取两个PCR反应呈阳性克隆的菌液各200 μ 1，进行基因测序，其核苷酸序列如SEQNO. 2所示；(6)菌液保种取步骤(4) PCR反应呈阳性克隆的菌液700 μ 1，加入300 μ I甘油，混匀，_80°C保存；所述的花鳗鲡生长激素基因的完整开放阅读框ORF (open reading frame),共630bp，其中有4个外显子，长度分别为150bp、117bp、162bp、201bp。其核苷酸序列如SEQN0. 2所示；由其推导的GH前体由209个氨基酸组成，包括长度为20个氨基酸的信号肽和189个氨基酸成熟肽如SEQN0. I所示。3. 8重组生长激素表达载体的构建3. 8. I花鳗鲡GH基因ORF片段双酶切(I)采用50 μ I双酶切体系(见表4)，将花鳗鲡GH基因ORF片段置于37°C恒温箱·中酶切3h ；表4双酶切体系
反应物体积
BamHl2.5μ1
XhoI2juiIOxFAST BUFFER5μΙ PCR回收产物 30μ1 eld H2O 10μ13. 8. 2花鳗鲡GH基因ORF片段双酶切产物的过柱回收按照Biomiga公司的PCR产物纯化回收试剂盒使用说明操作,步骤如下(I)在双酶切产物中，加入2倍体积的Buffer GC,涡旋充分混匀；(2)转移700 μ L DNA/Buffer GC混合溶液至离心柱中，室温13，OOOx g离心lmin,弃废液，将离心柱放回收集管中；重复此步骤使剩余的溶液通过柱子；(3)加入300 μ L of Buffer GC到离心柱中，室温13，OOOxg离心40s,弃废液;(4)加入650 μ L DNA Wash Buffer (确保已将乙醇按说明书要求加入DNA WashBuffer中),室温、13，OOOxg离心30s，弃废液;重复步骤4 ；(5) 13，OOOxg开盖再次离心3min，以去除柱中残余的乙醇；(6)将柱子放入干净的I. 5mL离心管中，向柱中加入在60°C预热的50 μ LElutionBuffer ;在室温放置Imin ;13，OOOxg离心Imin以洗脱DNA ;将洗脱液重新上柱,再次离心洗脱；离心管中溶液即为回收产物；(7)将回收后产物电泳检测(使用新鲜电泳缓冲液)，拍照保存；3. 8. 3双酶切产物连接上述双酶切后的PET32a及PCR双酶切后回收产物按照下述体系在16°C酶连仪上连接过夜，于4°C保存。表5连接体系
权利要求
1.一种花鳗鲡生长激素，其特征在于其氨基酸序列如SEQ NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的花鳗鲡生长激素，其特征在于编码所述的花鳗鲡生长激素的核苷酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.权利要求I或2所述的花鳗鲡生长激素的应用，其特征在于所述的花鳗鲡生长激素在花鳗鲡的养殖中进行应用。
全文摘要
本发明公开了一种如SEQ NO.1所示花鳗鲡生长激素及其编码基因和应用。本发明首次通过对花鳗鲡的生长激素基因进行克隆测序后进行相关分子生物学分析，通过基因表达得到的花鳗鲡生长激素能够有效促进花鳗鲡鱼苗的生长，解决了养殖过程中花鳗鲡苗种生长速度缓慢的问题，为花鳗鲡人工养殖和可持续发展提供新的解决方法。本发明提供的花鳗鲡生长激素有利于大规模的推广应用，可用于花鳗鲡的规模化养殖，具有较好的经济效益。
文档编号A01K61/00GK102838672SQ20121027920
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者刘文生, 张细权, 李梦溪, 聂庆华, 尹立路, 庞博, 刘满清 申请人:华南农业大学