专利名称：一种枯草芽孢杆菌dj-6菌株及在葡萄病害防治上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌mbtiiism-b菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物农药技术领域。
背景技术：
由植物病原真菌围小丛壳菌(Mlomerella ci/ 济侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌iPhysalospora侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌iAlternaria viticola)引发的葡萄穗轴褐腐(枯)病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属iPlasmopara vi ticola)侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌(此cinerea )侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌ampelina)侵染引发的葡萄黑痘病是我国葡萄上发生的主要病害。 葡萄病害当前主要通过化学防治来防控，常用以下化学药剂防治甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、波尔多液(bordeaux mixture)、五氯酌·钠(sodiumpentachlorophenol)λ 乙酸铜(cupric acetate)、啼菌酯(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、啼霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯 B亏菌酯(enestroburin)、氟吗啉(fIumorph)、P定酉先菌胺(boscalid)、甲霜灵(metalaxyl)、霜霉威(propamocarb)、多菌灵(carbendazim)、咪鲜胺(prochloraz)、卩比唑醚菌酯(pyraclostrobin)和烯酰吗啉(dimethomorph)等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成葡萄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗(耐)药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。目前成功用于防治葡萄病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制葡萄病害的生防菌属(种)主要有(I)木霉菌属真菌spp.)中的绿色木^ (Trichoderma viride)^(Trichoderma harzianum^)和长枝木霉舰longi brachi a turn ) ； (2)芽抱杆菌属细菌spp.)中的枯草芽抱杆菌
錯质芽抱杆菌{Bacillus cereus)、多粘芽抱杆菌(抱^77心polymyxa )、巨大芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌amyloli quefaci ens ) ； (3)
单格孢菌(Ulocladium a trum) ; (4)链霉菌属细菌焊c^spp.)中的灰绿链霉菌(Streptomyces griseovirides) λ{Streptomyces hygroscopicus)Λ^(51 treptomyces aureochromogenes)矛口链霉菌(51 treptomyces kitasazwaensis) ； (5) {叚单胞菌属细菌spp.)中的洋葱假单胞菌(Pseudomonas、焚光假单胞
细菌(/ ^肌/7和恶臭假单胞菌(/ ^肌/6_9/ 狀putlda); (6)酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母CPicAia guiIIiermondii)和罗伦隐球酵母Iaurentii)
坐寸O本发明提供的可同时兼治葡萄多种病害的颉颃细菌枯草芽孢杆菌DJ-6菌株，在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
本发明解决现有技术存在的不足，提供一株分离自黄杜鹃花的内生芽孢杆菌枯草芽孢杆菌UaciBm subtilis)V)i-&菌株，该菌株可用于防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。同时本发明还提供用该枯草芽孢杆菌DJ-6菌株加工成悬浮剂的制备方法。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明的枯草芽孢杆菌(拉丁文学名为Bacillus subtil is )DJ-6菌株，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 6314。本发明的菌种具有如下特征
(1)DJ-6菌株的细胞形态及生理生化特征(见表I)
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌SMiiJi1S)DJ-6菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 6314。
2.根据权利要求I所述的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株，其特征在于该菌株的16SrRNA基因序列为
3.根据权利要求I所述的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株，其特征在于该菌株的gyrB基因序列为
4.权利要求I所述的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病方面的应用。
5.一种用权利要求I所述的枯草芽孢杆菌DJ-6菌株发酵液制备而成的悬浮剂。
6.一种制备权利要求4所述的悬浮剂的方法，其特征在于包括以下步骤(A)菌液的获得 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 °C >200 rpm条件下振荡培养16h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30°C条件下振荡培养16 h ;把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐(镇江东方GUS-30)，20L发酵培养液中固容物含量为豆柏100g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、碳酸钙20 g、MnS04 1.0 g，设置发酵条件为溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 °C，发酵时间36 h，pH 7. 0-7. 2 ； (B)菌剂加工工艺 将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂 (I)将发酵液离心(8000 rpm)后用20%丙三醇溶液(V/V)(溶液用无菌水配制)重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液(V/V)调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为LOXIOki cfu/mL (即每毫升含100亿个活芽孢);(2)在上述调节好的悬浮液中按5 g/L (W/V)的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。
7.根据权利要求5所述的制备悬浮剂的方法，其特征在于步骤(B)中所述的悬浮剂中的添加剂为丙三醇和和黄原胶。
全文摘要
本发明为一种枯草芽孢杆菌DJ-6菌株(其在CGMCC的保藏编号为CGMCC No.6314)及发酵液制备成悬浮剂的方法。该制剂能有效防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。
文档编号A01P3/00GK102876605SQ201210354630
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月23日 优先权日2012年9月23日
发明者杨敬辉, 吉沐祥, 姚克兵, 庄义庆 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所