专利名称：一株枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的枯草芽孢杆菌及其用途，以及采用该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同时，也使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。海洋微生物是海洋生态系统的一个重要组成部分，具有在物种、基因组成和生态功能上的多样性。近海潮间带植物生境的微生物最富有生物多样性的海洋种群，其生境的独特性决定了该区域微生物较高的药用价值。海洋微生物产生药用活性物质一般是以菌株为单位的。即使是同种的微生物菌株在不同的生境下适应环境，代谢途径不同，产生的药用物质不同。目前海洋微生物分布的生境主要分为近海、深海和极地。其中近海生境种微生物不论从种类还是数量上都远远超过后两种生境，其中潮间带是近海区域的重要组成部分。目前，有5000种新的海洋天然产物被发现，其中大多数是有海洋微生物产生的。作为海洋生物组成种类最多的一类生物，专家学者认为海洋微生物仍有99.5% 99.9%未被认识，因此有着巨大的开发潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的芽孢杆菌——枯草芽孢杆菌RC-1。本发明的枯草芽孢 杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) RC_1，是从山东省潍坊市潍北地区近海潮间带海泥中分离获得的，已于2013年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为N0.7501。其具有以下生物学特性:在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28 °C下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。本发明枯草芽孢杆菌菌株RC-1的培养方法或繁殖方法包括:(I)普通培养保存采用LB培养基，配方为:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠IOg,琼脂 15-20g,蒸馏水 IOOOmL, pH 调至 7.0-7.2 ；(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠IOg,蒸馏水IOOOmL, pH调至7.0-7.2 ；
(3)大量发酵培养，配方为:黄豆粉3.0%，玉米粉3.0%，NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余为水。本发明还提供一种用于防治植物土传病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的枯草芽孢杆菌菌株RC-1。并且，本发明还提供了一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土传病害的植物施用上述枯草芽孢杆菌菌株RC-1或者上述生物防治制剂。本发明也提供了上述枯草芽孢杆菌菌株或者上述生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。就上述生物防治制剂、生物防治方法以及用途而言，所述植物病害可以选自辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病等中的一种或几种。本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤:(I)将保存的枯草芽孢杆菌菌株RC-1转移至NA试管斜面中，置于培养箱26°C恒温培养2-3d ；(2)将步骤(I)的枯草芽孢杆菌菌株RC-1的孢子移植到LB液体培养基中，28°C摇床振荡培养24h得到种子液；(3)按3.0%比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基(配方同上)中，培养温度26°C，培养时间36h，通风比1:0.8。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达100亿/g°(4)将步骤(3)的发酵液与基质(选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种)进行混合均匀，干燥，经干燥后菌数可达500亿/g。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1。实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株RC-1具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，包括辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病等中的一种或几种。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11、枯草芽孢杆菌(B.subti lis)菌株RC-1的分离与纯化本发明的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株RC-1是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为:
⑴芽孢杆菌的分离:土样的采集，山东省潍坊市潍北地区近海潮间带海泥(表层以下10 12cm)。采集样品均保存在无菌瓶中，标明采集地点、时间和采集人。采集结束后当天直接用新鲜海泥样品进行分离。称取Ig土样于IOOmL无菌水中，置于30°C摇床中150rpm震荡lOmin，然后置于60°C水浴锅中孵育30min，取100 μ L10_2、10_3、10_4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30°C培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。⑵辣椒炭疽病高效拮抗芽孢杆菌的筛选①初筛:采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在辣椒炭疽病菌菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，移植在平板中央，四周2cm处接种芽孢杆菌株，置27°C生化培养箱培养。逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。②复筛:将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)RC-l。实验证明，该枯草芽孢杆菌原粉在防治辣椒炭疽病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的枯草芽孢杆菌是具有广泛应用前景的枯草芽孢杆菌新菌株，可以用于制备 防治多种植物病害的生物防治制剂。2、菌株鉴定(I)微生物学特性:在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28°C下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。(2)分子生物学特性该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1 ):CTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC GGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCG GCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCAC CAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAG TCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTG TTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGA AAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGT CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCC CCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGA GAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG CGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGA ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGG GTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCC TAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGT TGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATG GACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTC AGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAC GAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGG GTGAC实施例21、枯草芽孢杆菌菌株RC-1发酵过程LB液体培养基，配方为:胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化钠IOg,蒸懼水IOOOmL, pH 调至 7.0-7.2。大量发酵培养基，配方为(重量比):黄豆粉3.0%，玉米粉3.0%，NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余为水。(I)将保存的枯草芽孢杆菌菌株RC-1转移至NA试管斜面中，置于培养箱26°C恒温培养2-3d ；·(2)将步骤(I)枯草芽孢杆菌菌株RC-1的孢子移植到LB液体培养基中，28°C摇床振荡培养24h得到种子液；(3)按3.0%比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度26°C，培养时间36h，通风比1:0.8。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达100亿/g。(4)将步骤(3)的枯草芽孢杆菌发酵液与基质(选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种)进行混合均匀，干燥，经干燥后发酵液菌数500亿/g。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1。实施例3枯草芽孢杆菌菌株RC-1对辣椒炭疽病菌室内效果验证1.实验方法采用平板对峙培养法，将供试的辣椒炭疽病菌菌饼(5mm)移至平板中央，四周2cm处接种RC-1菌株，置27°C生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。2.结果由表I可以看出，枯草芽孢杆菌菌株RC-1对辣椒炭疽病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，抑菌带直径为15.16_，菌丝生长抑制率为83.17%。表1.枯草芽孢杆菌菌株RC-1对辣椒炭疽病菌室内抑菌活性测定
权利要求
1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株RC-1，所述菌株的保藏号为CGMCCN0.7501。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株RC-1在防治植物土传病害中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病中的一种或几种。
4.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株 RC-1。
5.一种制备权利要求4所述的生物防治制剂的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)将保存的枯草芽孢杆菌菌株RC-1转移至NA试管斜面中，置于培养箱26°C恒温培养 2-3d ； (2)将步骤(I)的枯草芽孢杆菌菌株RC-1的孢子移植到LB液体培养基中，28°C摇床振荡培养24h得到种子液；所述LB液体培养基为:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水 IOOOmL, pH 调至 7.0-7.2 ； (3)按体积比3.0%的比例将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度26°C，培养时间36h，通风比1:0.8，发酵完成后得到发酵液；所述大量发酵培养基按重量比计为:黄豆粉3.0%，玉米粉 3.0%, NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余为水； (4)将步骤(3)的发酵液与基质进行混合均匀，干燥；所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1 ;所述基质选 自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种。
6.权利要求4所述的生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病中的一种或几种。
8.一种植物土传病害的生物防治方法，其特征是，向具有土传病害的植物施用权利要求I的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株RC-1或者权利要求4的生物防治制剂。
全文摘要
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物防治植物病害领域。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RC-1，保藏号为CGMCC No.7501。本发明还公开了一种包括上述菌株的生物防治制剂及其制备方法。本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，包括辣椒炭疽病等。
文档编号A01P3/00GK103194415SQ20131014553
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者李鹏, 牛赡光, 王清海, 李泉涌, 刘幸红, 李红梅 申请人:牛赡光, 李鹏