爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法
【专利摘要】本发明公开了元紫红爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，先将玉米自交系幼胚诱导出愈伤，经两次继代，选取其中玉米胚型愈伤组织，直接再生成完整植株，所述玉米自交系为N10或N04本发明就爆裂玉米研究的基础上，进一步对其再生体系进行构建及优化，从而为以爆裂玉米自交系为受体进行遗传转化提供平台。本发明提供一种遗传转化的材料，利用爆裂玉米自交系作为转化受体，背景纯合，省略掉与轮回亲本多次回交的工作，而且易于观察转化后代的表现型。本发明可以为爆裂玉米的转化提供平台，减轻了转化后数代回交的工作量。且爆裂玉米植株，籽粒均有自己独特的特点，便于转化后代表现型的鉴定。
【专利说明】爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种玉米培育方法，具体涉及爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法。
【背景技术】
[0002]目前，随着玉米自交系B73大规模测序的完成，克隆了很多有用基因，加之基因工程技术手段的不断发展和日趋完善，为转基因育种打下了良好的基础。自从1984年第一株转基因植株的获得，世界开展了对转基因技术的各项研究，同时也对玉米进行性状改良和基因功能的研究。玉米遗传转化已是国内外的研究热点之一。
[0003]要做转基因的相关研究就要有优良的转化体系， 当今世界对普通玉米的转化体系已研究甚多，尤其是利用杂交种HiII的转化研究，但转基因后代需要进行多代的回交来纯化遗传背景，才能得到研究者所需要的转基因材料。近年来，研究者们也致力于研究玉米自交系的再生体系。2011年，田风龙对玉米自交系齐319、昌7-2、18-599和178的幼胚诱导愈伤，然后用农杆菌侵染的方法得到了 DWF4的转基因植株。2011年，季丽丽等以922、H99、丹598和丹988四个玉米自交系为材料，优化了幼胚愈伤组织的诱导调节。2009年，陶芳等分别用法059、4K060、4K061、4K261、4K2965个高油玉米自交系的幼胚建立并优化了其再生体系。2007年，侯丽红分别用高油玉米自交系GY220、GY246、GY302、GY798和GY923的幼胚建立了其再生体系。2004年，胡建广等以超甜玉米自交系S1、S2、S3和粤甜3号等幼胚为试验材料，建立其高效成株系统。2007年，梁雪莲等以香白糯玉米幼胚为实验材料，建立其再生体系，并以农杆菌介导的方法成功得到了 cpTI和Bar基因的转化植株。而对爆裂玉米再生体系及其遗传转化的研究至今还是空白。爆裂玉米自交系遗传转化的研究具有颇多优点。首先，与普通玉米相比，爆裂玉米生育期较短；其次，与普通玉米相比，爆裂玉米植株小，各植株性状均具有显著差异；且其籽粒小，便于观察具有差异的表现型。若研究的相关基因是控制植株性状、籽粒大小、产量等方面的，以爆裂玉米为受体进行遗传转化，通过对后代各性状的调查，可以很容易得到表现型的相关数据，进而可实现对相关基因的深层次研究。再次，以爆裂玉米自交系为受体的遗传转化，筛选所得Tl代阳性植株即有表现型，不需要再进行多次回交纯化遗传背景，即可在早代进行分析比较，省时省力。最后，爆裂玉米本身就具有较高的营养价值，通过遗传转化来实现高产，也是一个重要的研究方向。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法。
[0005]本发明的技术方案是:爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，先将玉米自交系幼胚诱导出愈伤，经两次继代，选取其中玉米胚型愈伤组织，直接再生成完整植株，所述玉米自交系为NlO或N04，它的步骤如下:
(I)取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗灭菌处理后，在超净工作台中拨取幼胚，胚轴朝下放在诱导培养基上，诱导出第一次玉米愈伤组织；
(2)由步骤(1)得到的第一次玉米愈伤组织切去胚芽转移到新的诱导培养基上，15天后得到第二次玉米愈伤组织；
(3)由步骤(2)得到的第二次玉米愈伤组织夹碎后转移到新的诱导培养基上，每隔15天继代一次，继代两次，得到玉米胚型愈伤组织；
(4)由步骤(3)得到的玉米胚型愈伤组织转移到分化培养基上得到玉米丛生苗；
(5)将步骤(4)得到的玉米丛生苗分成单个苗，转入生根培养基中再生成完整植株。
[0006]所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中N04的诱导培养基是:MS基本培养基4 g/L+N6 维生素(1000x)Iml + 2，4-D 0.4 mg/L + L-脯氨酸 5 g/L + 鹿糖 30 g/L + 肌醇 0.1g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + AgNO3 36 μ M/L + 植物凝胶 3 g/L, pH 为 5.8。
[0007]所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中NlO的诱导培养基是:MS基本培养基4 g/L+N6 维生素(1000x)Iml + 2，4-D 2 mg/L + L-脯氨酸2.76 g/L + 蔗糖30 g/L + 肌醇0.1g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + AgNO3 13 μ M/L + 植物凝胶 3 g/L, pH 为 5.8。
[0008]所述步骤(4)中的分化培养基是:MS基本培养基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + 植物凝胶 3 g/L, pH 为 5.8。
[0009]所述步骤(5)中生根培养基是:MS基本培养基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30g/L + NAA 0.2 mg/L + 植物凝胶 30 g/L, pH 为 5.8。
[0010]本发明的有益效果是:本发明就爆裂玉米研究的基础上，进一步对其再生体系进行构建及优化，从而为以爆裂玉米自交系为受体进行遗传转化提供平台。本发明提供一种遗传转化的材料，利用爆裂玉米自交系作为转`化受体，背景纯合，省略掉与轮回亲本多次回交的工作，而且易于观察转化后代的表现型。本发明可以为爆裂玉米的转化提供平台，减轻了转化后数代回交的工作量。且爆裂玉米植株，籽粒均有自己独特的特点，便于转化后代表现型的鉴定。
【具体实施方式】
[0011]爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，先将玉米自交系幼胚诱导出愈伤，经两次继代，选取其中玉米胚型愈伤组织，直接再生成完整植株，所述玉米自交系为NlO或N04，它的步骤如下:
(1)取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗灭菌处理后，在超净工作台中拨取幼胚，胚轴朝下放在诱导培养基上，诱导出第一次玉米愈伤组织；
(2)由步骤(1)得到的第一次玉米愈伤组织切去胚芽转移到新的诱导培养基上，15天后得到第二次玉米愈伤组织；
(3)由步骤(2)得到的第二次玉米愈伤组织夹碎后转移到新的诱导培养基上，每隔15天继代一次，继代两次，得到玉米胚型愈伤组织；
(4)由步骤(3)得到的玉米胚型愈伤组织转移到分化培养基上得到玉米丛生苗；
(5)将步骤(4)得到的玉米丛生苗分成单个苗，转入生根培养基中再生成完整植株。
[0012]所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中N04的诱导培养基是:MS基本培养基4 g/L(购自 Sigma 公司，货号为 m0404)+N6 维生素(1000x) Iml + 2，4-D 0.4 mg/L + L-脯氨酸 5g/L +蔗糖30 g/L +肌醇0.1 g/L +水解酪蛋白0.1 g/L + AgNO3 36 μ M/L +植物凝胶3 g/L，pH 为 5.8。
[0013]所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中NlO的诱导培养基是:MS基本培养基4 g/L(购自 Sigma 公司，货号为 m5519)+N6 维生素(1000x) Iml + 2，4-D 2 mg/L + L-脯氨酸 2.76g/L +蔗糖30 g/L +肌醇0.1 g/L +水解酪蛋白0.1 g/L + AgNO3 13 μ M/L +植物凝胶 3 g/L，pH 为 5.8。
[0014]所述步骤(4)中的分化培养基是:MS基本培养基4 g/L (购自Sigma公司，货号为m5519) + 肌醇 0.1 g/L + 蔗糖 30 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + 植物凝胶 3 g/L,pH 为 5.8。
[0015]所述步骤(5)中生根培养基是:MS基本培养基4 g/L (购自Sigma公司，货号为m5519) + 肌醇 0.1 g/L + 蔗糖 30 g/L + NAA 0.2 mg/L + 植物凝胶 30 g/L,pH 为 5.8。
[0016]接种与培养:取授粉后10-11天的幼穗，70%酒精对苞叶进行逐层灭菌处理，剥去苞叶的玉米幼穗放入超净工作台中，用5%的次氯酸钠灭菌处理，20分钟后，取出幼穗，用解剖刀切去一半的胚乳，然后拨取幼胚，胚轴朝下放在诱导培养基上。27土1°C暗培养3-5天后即可看到幼胚膨化长出胚芽，切去胚芽，把已膨化的幼胚转移到新鲜的诱导培养基上，
2-3周后即可看到形成的胚型愈伤。形成的胚型愈伤组织就可转移到分化培养基上，分化培养一周左右，在胚型愈伤表明即可看到有绿色芽点形成。继续培养一周后，开始有丛生苗分化出来，将丛生苗分割开来，每个苗分别转移到生根培养基诱导生根。
[0017]本发明中愈伤组织的诱导，愈伤组织的分化及生根培养均在室内进行，在愈伤组织的培养阶段，不需要光照的暗培养调条件是:温度:27土1°C，培养时间:24h，在愈伤组织分化和生根培养阶段采用光照培养 室培养，培养温度:27土 TC，光照强度:1500-20001χ，每天光照14h。
【权利要求】
1.爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，其特征在于，先将玉米自交系幼胚诱导出愈伤，经两次继代，选取其中玉米胚型愈伤组织，直接再生成完整植株，所述玉米自交系为NlO或N04，它的步骤如下: (1)取人工自交授粉后10-11天的玉米幼穗灭菌处理后，在超净工作台中拨取幼胚，胚轴朝下放在诱导培养基上，诱导出第一次玉米愈伤组织； (2)由步骤(1)得到的第一次玉米愈伤组织切去胚芽转移到新的诱导培养基上，15天后得到第二次玉米愈伤组织； (3)由步骤(2)得到的第二次玉米愈伤组织夹碎后转移到新的诱导培养基上，每隔15天继代一次，继代两次，得到玉米胚型愈伤组织； (4)由步骤(3)得到的玉米胚型愈伤组织转移到分化培养基上得到玉米丛生苗； (5)将步骤(4)得到的玉米丛生苗分成单个苗，转入生根培养基中再生成完整植株。
2.根据权利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，其特征在于:所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中N04的诱导培养基是:MS基本培养基4 g/L +N6维生素 I ml + 2, 4-D 0.4 mg/L + L-脯氨酸 5 g/L + 鹿糖 30 g/L + 肌醇 0.1 g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + AgNO3 36 μ M/L + 植物凝胶 3 g/L, pH 为 5.8。
3.根据权利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，其特征在于:所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中NlO的诱导培养基是:MS基本培养基4 g/L +N6维生素 Iml + 2, 4-D 2 mg/L + L-脯氨酸 2.76 g/L + 鹿糖 30 g/L + 肌醇 0.1 g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L+ AgNO3 13 μ M/L + 植物凝胶 3 g/L, pH 为 5.8。
4.根据权利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，其特征在于:所述步骤(4)中的分化培养基是:MS基本培养基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + 植物 凝胶 3 g/L, pH 为 5.8。
5.根据权利要求1所述的爆裂玉米幼胚愈伤组织诱导和植株再生的方法，其特征在于:所述步骤(5)中生根培养基是:MS基本培养基4 g/L +肌醇0.1 g/L +蔗糖30 g/L +NAA 0.2 mg/L + 植物凝胶 30 g/L, pH 为 5.8。
【文档编号】A01H4/00GK103477980SQ201310401998
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】李玉玲, 董永彬, 薛晓静 申请人:河南农业大学