内共生细胞器的检测方法和从中可鉴定的化合物的制作方法

专利名称：内共生细胞器的检测方法和从中可鉴定的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病的诊断和/或细胞生物体(cellular organism)功能的测定，所述的细胞生物体可以是多细胞的或者单细胞的，可以是肉眼可见的或者是微生物。
背景技术：
研究细胞生物体功能(障碍)的疾病诊断专家可以对该生物体进行广泛的深入调查以获得关于功能障碍各个方面的相关信息。这些深入调查范围很广，比如可通过研究来自不同病人的尿样检验肾结石的相对比率，通过内镜检查探查有无肠道溃疡，利用核磁共振(NMR)扫描发现肿瘤，通过血浆中的胰岛素水平和/或葡萄糖浓度检测糖尿病，通过测定癌基因的转录水平确定癌变倾向等等。
目前对较高等生物体如动物和植物疾病或者功能障碍的测定(或与之相反，健康和正常功能的检测)依赖于从这些生物体获得的样品并在实验室中对这些样品进行研究来完成。人们发现对确定、鉴别或测定生物体的疾病或功能障碍有效的方法通常在测试或者筛选治疗或引发这种疾病或功能障碍的化合物或者方法方面也是有用的。可以确定，鉴定或检测疾病的多个方面的方法，通常能评价这样的候选化合物或方法在治疗或引发我们正在谈论的疾病或功能障碍中的有效性。显然，生命科学实验室一直都需要通过对生物体的其它深入研究来获得与疾病或者功能障碍有关以及关于引发或治疗疾病或功能障碍相关化合物和方法的更多的信息。

发明内容
本发明提供了一种细胞生物体功能(障碍)的测定方法，该方法包含了测定来自生物体的样品中内共生细胞器核酸和/或其基因产物与另一种核酸或基因产物的相对比例。在本发明中，术语″相对比率″是指将所述的第一种内共生细胞器核酸和/或它的基因产物的量与所述的第二种核酸和/或它的基因产物的量进行比较。例如，所述的相对比率可能是以第二种核酸或它的基因产物的量除第一种内共生细胞器核酸或它的基因产物的量得到的数值，或反之。该一种或者两种化合物的量还可被一个参考值除或者减。在此处细胞生物体功能的测定是指检测细胞生物体是否处于健康状态，或者生物体是否受到某些影响，如疾病和/或(有毒的)的化合物。疾病和/或(有毒的)化合物对生物体的影响达到一定程度后，可能会呈现出临床症状。也有可能疾病和/或(有毒的)化合物对生物体有影响但尚没有表现出临床症状。
内共生细胞器包括那些被认为来源于真核细胞进化早期、存在于真核细胞中的原核细菌所形成的细胞器。这些细菌(如它们被认为的那样)与早期的真核细胞共生，而且现在包含这些内共生细胞器的真核细胞一般都不能在没有细胞器的情况下存活。如今的真核细胞还没有一种能在没有线粒体的情况下发挥正常功能，而且大多数植物细胞如果没有原质体或者其来源的细胞器如叶绿体、白色体(etioplast)、造粉体(amyloplast)、造油体(elaioplast)或有色体(chromoplast)的话，至少也会发生功能障碍。一般而言，这些细胞器好象至少是部分自我复制的，虽然也受细胞核的控制，但是仍有相当的自主性。
特别的，本发明提供了一种方法，通过这种方法，所述的内共生细胞器核酸和/或它的基因产物的相对比率是由所述样品中检测到的基本上为细胞核核酸的量(其可以是DNA或RNA)，或所述的细胞核核酸(此处的细胞核核酸包含染色体DNA及转录的RNA)存在于所述样品细胞核或细胞质组分或者部分中的基因产物(通过转录和/或翻译得到，如mRNA或(多)肽)决定的。编码小核糖核蛋白(SNRNP)的DNA或相应的mRNA、或者其它来自染色体DNA的基本上共同的核酸，因为它们是广泛存在的，所以对于测试来说是特别有用的。在这方面，本发明提供了研究内共生细胞器如线粒体和原质体(proplastid)相关疾病的一种方法。此处的内共生细胞器相关疾病是指某种情况下，所述的内共生细胞器的核酸和/或它的基因产物的量和/或至少有一种特性与自然情况不同，例如所述核酸的表达可能减少了。内共生细胞器相关疾病例如由缺陷的所述细胞器DNA编码，表现在许多不同的综合症中，而且由于异质性(heteroplasmy)，它的表达多变(而且因此一般很难仅仅通过测验临床参数来检测)，而异质性也是为何突变型和野生型核酸共存在一种细胞中以及它的分布发生改变的原因。内共生细胞器相关疾病通常随着受影响个体的年龄增大而恶化。当用各种药物对其它的疾病进行治疗后往往也会观察到内共生细胞器相关疾病，然后内共生细胞器相关疾病促成这些药物的多种副作用，而这些副作用是治疗时意欲避免的。现在这些副作用可使用此处提供的方法更好地进行研究。
此外，本发明还提供了一种方法，根据此方法，所述的一种内共生细胞器核酸和/或它的基因产物的相对比率由所述样品中能检测到的另一种(不同的)内共生细胞器核酸(其可以是DNA或RNA)的量，或由所述的内共生细胞器核酸的基因产物(由转录和/或翻译得到，如mRNA或(多)肽)决定。本发明的一个方面还包括了测定细胞器DNA(如mtDNA)和与之相应的转录后的细胞器RNA(例如相关的mtRNA)或者翻译后的基因产物的比率。这种方法可以测定转录和/或翻译的水平。当转录和/或翻译的水平与自然水平相比有所改变时，则表示所述细胞的功能也发生了变化。所说的功能改变可能是因为某种疾病或某个特定的治疗副作用所导致的所述细胞器的功能障碍，而所述的功能障碍可能包含如转录水平的降低等。或者，所述的功能改变也可能是所述细胞器的功能改善，例如在内共生细胞器相关疾病的治疗和/或治愈过程中。
所述的功能障碍可能也包含转录水平的增加。一种疾病或一种疾病的治疗可能涉及内共生细胞器DNA的减少。然而，所说的减少在所述疾病的第一阶段至少能够部分地从所述DNA转录水平的增加得到补偿。这样，源自所述的内共生细胞器DNA的RNA的量可能一点也不会减少，或者相对于所述的内共生细胞器DNA而言减少的程度少一点。那样的话所述疾病或治疗的症状可能还(完全地)感觉不到。然而，若所述的内共生细胞器DNA的量进一步减少，来自所述DNA的RNA的量最后也将明显地降低。然后副作用发生了。照惯例，往往根据副作用的临床表现来决定是治疗这种疾病还是把治疗减少或者停止治疗。但是，在这种传统的方式下，病人已经遭受了所述的副作用造成的痛苦。不过，如果用本发明中的方法，包括临床症状的副作用就能够被预测。例如，内共生细胞器核酸的转录和/或翻译水平的改变是细胞生物体功能改变如所述的生物体遭受(未来的)副作用的一种指征。内共生细胞器DNA和/或它的基因产物与细胞核核酸或其基因产物的相对比率的改变也是细胞生物体功能变化的一种指示。
本发明的另一种方面测定了两个不同的细胞器DNA或其相关基因产物间的比率。一方面，提供的本发明的方法中所述的第一种内共生细胞器核酸和第二种内共生细胞器核酸都来自同一种细胞器。例如，所述的细胞器包含线粒体。
本发明中的方法尤其适于疾病的分期。一种生物体可能已经受到了某种疾病的影响，虽然基本上还没有或者几乎没有临床症状。但是，虽然基本没有表现出临床症状，但一种内共生细胞器核酸和/或基因产物与另一种内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率可能已经改变了。如实施例所示，所述的相对比率的所述改变可以在临床症状和/或传统测试方法，如测定乳酸丙酮酸的比率之前检测到，显示生物体的功能改变。因此，所述的相对比率非常适于确定某种特定疾病的分期。所以本发明的一方面提供了一种确定疾病的分期的方法，包含确定从正经受或将会经受所述疾病的生物体所取的样品中内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率。
本发明的一种用于疾病分期的方法也可用来诊断疾病。例如，人们可以按一定的时间间隔用本发明中的方法进行常规检测，他们也可以在出现临床症状后进行测试。所述的相对比率的改变指示疾病发展到了某种程度。所述疾病的种类不必用本发明中的方法诊断。本发明还可用于候选药物的测试，发现可能的药剂或药学组分如抗寄生虫化合物，抗生素以及细胞增殖抑制剂等候选物的有益活性和/或副作用。例如，本发明提供了一种确定候选化合物治疗活性和/或可能的副作用的方法，比如测定候选化合物在治疗细胞生物体功能障碍中的有效性，包含测定来源于所述生物体的样品中内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率，优选地所述生物体或者基本相关的生物体(如属于同一种种或属)为经过所述化合物处理过的。如果用所述的候选化合物处理所述的生物体后，该生物体的内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率发生了改变则显示所述的候选化合物用于该生物体时会产生治疗和/或副作用。此外，这也表明该化合物用于基本相关的生物体时也有治疗和/或副作用。因此，当用本发明中的方法来确定一种候选化合物在细胞生物体功能障碍治疗中的治疗活性和/或副作用时，并非必须使用同一种生物体，也可使用基本相关的生物体。
另一方面，本发明提供了确定一种药剂治疗活性和/或可能的副作用的方法，包含测定来源于所述生物体的样品中内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率，优选地所述生物体是经过所述的药剂处理过的。根据本发明，治疗活性是指至少能部分的治疗疾病的能力。在本发明的一个实施例中，所述的治疗活性包含针对一种HIV相关疾病和/或一种肿瘤相关疾病的治疗活性。例如，所述的药剂包含了cytostaticum，它可以与其它的抗逆转录病毒治疗方法适当结合。根据荷兰的ATHENA研究，接受一种逆转录治疗的病人中有40％由于不良的副作用而需要更换逆转录治疗。因此，本发明中的方法在这样的治疗中是非常受欢迎的，因为所述的方法能在(严重的)临床症状出现之前发现副作用。然后所述的治疗就可在所述的临床症状出现之前就停止和/或更换。那样的话所述的临床症状就不会或者在较小的范围内出现。这将防止很多痛苦。因此在其优选的方面，本发明提供了一种方法，其中当使用该方法时，所述的副作用可以基本上不出现。根据本发明，“基本上不出现”是指副作用没有(还没有)、或只有部分有临床症状。
一方面，本发明中所提供的方法中所述的化合物或药剂包含cytostaticum。通常使用的cytostatica包含如烷化剂、antimitotoxiccytostatica、抗肿瘤抗生素和拓扑异构酶抑制剂等。其中非限制性的例子包含chloorambucil、环磷酰胺(cyclofosfamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosamide)、melfalanthiotepabusulfan、曲奥舒凡(treosulfan)、卡氮芥(carmustne)、环己亚硝脲(lomustine)、顺铂(cisplatine)、卡铂(carboplatine)、奥沙利铂(oxaliplatine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲基苄肼(procarbazine)、替莫佐胺(temozolomide)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地新(vindesine)、多舍他西(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、柔红霉素(daunorubicine)、阿霉素(doxorubicine)、表阿霉素(epirubicine)、去甲氧柔红霉素(idarubicine)、米托蒽醌(mitoxanthron)、博来霉素(bleomycine)、放线菌素D(dactinomycine)、丝裂霉素(mitomycine)、伊立替康(irinotecan)、托泼替坎(topotecan)、足叶乙甙(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)安丫啶(amsacrine)、左旋门冬酰胺酶(asparaginase)、cladribine、hydroxyarbaide、喷司他丁(pentostatine)、甲氨喋呤(methotrexaat)和/或雷替曲塞(raltitrexed)。在抗逆转录病毒治疗和/或肿瘤相关疾病的治疗期间常常使用核苷和/或核苷酸类似物。这些类似物很容易出现副作用，因为它们干扰生物体的复制和/或转录过程。然后内共生细胞器核酸的量也常常有所改变。因此，当用包括核苷和/或核苷酸类似物的药剂处理生物体时，很适合用本发明中的方法进行测定。
一方面，本发明提供了一种方法，其中所述的化合物或药剂包含了核苷和/或核苷酸类似物。这种类似物的非限制性实例是氟达拉滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和/或gemeytabine。而另一方面，本发明提供了一种方法，其中所述的化合物或药剂包含AZT、ddI、ddC、d4T、3TC和/或替诺福韦(tenofofir)。本发明的方法中所述生物体或基本上相关的生物体已经优选地与所述化合物或生物体一起提供。
某些疾病如HIV相关疾病的治疗不得不需要很长的一种时期。本发明中的方法尤其适于在长的时期内进行治疗的疾病。在所述的长时期内，会有很多副作用出现，不过现在病人能在(还)没有临床症状就进行有规律的检测。因此，一方面本发明中提供的方法中所述的药剂至少使用了3个月，优选地至少6个月，更优选地至少12个月。一方面提供了本发明的一种方法，其中在至少3个月的时间内使用所述药剂，优选在至少6个月的时间内使用所述药剂。一方面，所述的药剂用于慢性疾病的治疗。此处的慢性病是指那种不能被完全治愈的疾病。一旦个体获得了所述的这种疾病，虽然临床症状会不断的变化，但所述的疾病将一直存在于所述的个体中。所述的个体有时甚至不会注意到所述的症状。慢性病包含了如HIV-相关疾病之类的疾病。
此处的化合物的副作用是指所述化合物除了目的效应之外的其他作用。所述的副作用可能是不希望有的效应。例如，一种治疗化合物能解除疾病，但同时也降低了生物体的代谢。所述的代谢的所谓降低被称作(负的)副作用。或者，化合物的副作用也可能是一种有益的作用，如对另一种疾病的免疫力。
在此还提供了用于(选择性)检测毒素，如除草剂、杀虫剂、抗寄生虫化合物、抗生素等化合物的用途。本发明提供了一种测定候选化合物毒性的方法，例如确定它是否引起细胞生物体的功能障碍例如通过细胞增殖抑制甚至是细胞毒性效应，所述的方法包含测定来源于所述的生物体的样品中内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率，优选地所述生物体或相关生物体使用了所述的化合物。
在优选的实施方案中还对选择性进行了测试，其利用或应用此处提供的方法(优选地通过平行实验)检测一种生物体和另一种基本上无关的生物体，希望二者属于不同的科或目，优选地属于不同的种或门，最优选地是属于不同的界。例如选择性方面可通过测试一种靶生物体(如细菌或寄生虫)中(如果需要可只在其细胞中)以及其宿主或其细胞(属于基本上不相关的另一种生物体如哺乳动物或植物)中的所述的化合物，或者通过测试农作物或其细胞以及基本上不相关的杂草植物或其细胞中的所述的化合物来确定该化合物的选择性毒性或选择性治疗作用。它还可用于来源于个体的正常细胞与异常细胞的平行测试或比较测试，例如来源于同一个体的肿瘤细胞，检测或筛选用来治疗所述个体或其他有相似或相关疾病的个体的肿瘤特异的或至少具有选择性的细胞增殖抑制或细胞毒性的化合物。
例如，用本发明的方法确定相对比率可通过测量所述样品中所述核酸和/或基因产物的量来确定，通常在至少一种处理步骤之后，例如靶核酸的扩增。在测量完所述的量后，所述的相对比率可用一个量除以另一个量得到。
微量的靶核酸可通过酶扩增检测和定量。酶扩增技术包括如聚合酶链反应(PCR)1、核酸序列为基础的扩增(NASBA)2、SDA、TMA和其它技术。在扩增反应中加入两个引物序列就可实现靶核酸序列的特异扩增。扩增反应结束时，用所述的扩增区特异的探针就能检测扩增的区域。也可在所述的扩增反应中所述核酸的产生过程中检测到扩增的区域。在后面的这个方法中，当所述的探针与互补的核酸杂交后就可检测到探针上连接的标记信号。TaqMan3和分子信号探针4；5就是这样一种能在扩增反应中进行实时同源检测的探针。
靶核酸序列的定量通常通过加入一种竞争性分子来完成。竞争性分子使用与靶核酸同样的引物，而且其包括一段能区分竞争性分子和靶核酸序列的序列2；6。扩增的竞争性分子和靶核酸序列的比例可用来对所述的靶核酸进行定量。在扩增反应结束时或者在所述的扩增反应过程中，用竞争性分子或者靶核酸序列的特异探针对竞争性分子或者靶核酸序列进行检测。在后面的这个方法中，当所述的探针与互补的核酸杂交并且所述的靶核酸超过阈值时，就可检测到探针上连接的标记信号，检出阳性的时间或循环数。在另一种定量方法中，检出阳性时间可在不加竞争物的情况下定量。
其中，本发明中的方法在检测细胞生物体的功能(障碍)、候选药物的测试和选择性毒素的测试方面非常适合。已经用该方法完成了许多反应过程，而且证实这种方法是一种很有用的手段(见实施例)。当消除了结果中的双向扩散(double spreading)后，用本发明的方法可以得到一种更精确的结果。一般来说，本发明方法所得结果中的双向扩散是因不同反应混合物的条件不同所致。例如，扩增步骤对于检测和定量样品中的特异核酸通常是必须的。然而，核酸1反应混合物的温度可能比核酸2反应混合物的温度略微高一些，这样可能会使核酸1的产量较高，并且因此得到的核酸1与核酸2的量的比率高于核酸1混合物和核酸2混合物在同样的温度下扩增所得的比率。因为所述的混合物中所述温度的差异，最初样品中两个核酸的测定比率与二者的实际比率并不完全符合。同样地，其它条件的微小变化如加入的酶量也会导致核酸1和核酸2的测定量的改变。因此，核酸1和2的测量值可不依赖于对方而独立变化。所述测定量的独立变化会引起所述测定量的计算比率发生更大的改变。这就称做结果中的双向扩散。因此，此处的双向扩散是指由于至少两个反应混合物至少一种反应条件的变化所导致的所得结果中的至少一种变化。例如，两个反应混合物的体积总量也有些微的不同。
在一些特殊例子中，生物体由于某些疾病或治疗而使内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率结果中的双向扩散超出了变化值。例如，病毒聚合酶抑制剂经常用于HIV的治疗。病毒聚合酶抑制剂也对线粒体聚合酶γ有影响。因而在所述的HIV治疗期间，线粒体聚合酶γ会减少，导致每个细胞中的线粒体数量减少。如果线粒体减少50％就会产生副作用。因子2会降低线粒体DNA与细胞核DNA的比率。然而，在一些案例中，由于提到的条件的变化，因子2所引起的线粒体DNA的减少能包括所述比率测量中的双向扩散。因此由于结果中的双向扩散，这种生物学上的线粒体的重要差异不一定能检测到。所以一些实例中的双向扩散会降低核酸和/或它们的基因产物的比率中生物学上重要的差异的检测的可靠性。因此，本发明的一种实施方案提供了结果中没有双向扩散时测定细胞生物体功能的方法，包含测定来自所述生物体来源的样品中内共生细胞器核酸和/或它的基因产物与另一种内共生细胞器核酸和/或它的基因产物的相对比率。在优选的实施方案中，在同一个实验中测定比率可以防止双向扩散。这意味着处理步骤和/或至少两种核酸和/或它的基因产物的定量都在同一个实验中进行。根据本发明，实验通常使用一种反应混合物。本发明实验中的各个组分在所述的测定中最好随机地混合。所述的反应混合物可以放在一个反应管中。
然而，本领域的人员可以想更多的方法来防止结果中的双向扩散。例如他/她可以使用一种用(半)透膜分隔为不同部分的反应容器。只要一种反应条件随所述的不同部分而变化，则双向扩散就可避免而且所得的结果也更精确。
在当前这个发明的一个实施方案中，一个实验中至少扩增两个靶序列。所述的两个靶序列可以是所述的内共生细胞器核酸和所述的第二种核酸。因而当前这个发明的一个实施方案提供的发明方法包含在同一个实验中扩增所述的内共生细胞器核酸和所述的第二种核酸。当在同一个实验扩增至少两个靶序列时，所述实验中反应条件的改变能独立地影响所述的实验中每个序列的获得量。例如所述的实验中得到的每个序列的量将受到同样的温度，同样的总体积等的影响。然后利用两个特异探针在扩增反应期间扩增核酸产生过程中检测所述的两个靶序列。所述的两个探针可以分别加上两个能区分这两个探针、从而能区分两个不同序列的标记。可通过把检出阳性的时间与两个实时扩增反应的相对的荧光增加值结合来进行定量。优选地在此之前先做好参考曲线。然后通过比较获得的数值与参考值对所述核酸进行定量。因此不需要一种内部标准如竞争性分子。在同一个实验中的两个靶核酸的比较定量比两个单独的实验中的定量准确性高，而且所需的操作时间和试剂量都少。我们发现同一管中两个扩增反应为两个靶核酸的比率提供了立即的指征。两个扩增反应的条件是相同的，排除了条件的变化，而且也不需要使用内部或外部的校准器。因此，就避免了结果中的双向扩散。所以，一方面，本发明提供了一种方法，其中的相对比率直接由一种核酸的量除另一种来确定。优选地，所述的相对比率通过与参考值比较之后确定。根据本发明，直接确定是指两个靶核酸的比率能立即指示出来，例如通过比较所述的两个用不同荧光标记的特异性探针的强度来确定。在这个实施方案中，一种核酸的量除另一种就是一种核酸的相应的荧光强度除另一种的荧光强度。本发明方法中没有使用内部标准，其中所述的相对比率是直接确定的。
一方面，本发明中所述的细胞器核酸，它的基因产物，第二种核酸和/或其基因产物取自外周血单核细胞(PBMC)和/或成纤维细胞。本发明提供的一种方法，特别是单核细胞在使用时是首选，因为那样的话就能使用所述生物体的血液样品。血样易得而且量大，所以在优选的实施方案中提供的方法中所使用的样品包含了血样。
本发明的方法对于定量一种含量可变的靶核酸和/或其基因产物与一种含量稳定的靶核酸和/或其基因产物是特别有用的。一个例子是含量可变的线粒体DNA和含量稳定的核基因的DNA(每个二倍体细胞有两套)的定量。另一个例子包含了可变表达的RNA如线粒体RNA与细胞存活必需的组成性表达的RNA如编码参与剪切的SNRPU1A或者其它广泛存在的核DNA来源的必需核酸的定量。我们发现我们能够测定因子2 à3的相对比率。
一方面，本发明提供了一种发明方法，其中所述的第一种核酸包含了RNA，而且第二种核酸包含了DNA。本发明方法特别适合于如线粒体RNA的细胞含量与核基因如U1的细胞含量的定量。如实施例22所示。
而且，本发明提供了一种诊断试剂盒，其包含至少一种根据本发明来使用这个方法的方式，所述的试剂盒包含至少一种与内共生细胞器相关或来源于内共生细胞器的核酸扩增和检测用的选择性引物或探针，以及(如果需要)必需的扩增试剂，如详细的说明书中例证中或本专业其它地方所显示的那些。特别的，本发明提供了一种诊断试剂盒，其中所述的试剂盒包含为细胞器相关的核酸序列扩增所设计的一种以上的引物或探针，优选地补充了为染色体相关的核酸扩增所设计的引物或探针，如SNRP特异引物或探针。尤其本发明还提供了一种试剂盒，包含至少一种表1中用于扩增细胞器核酸序列引物或探针。毫无疑问优选地，试剂盒提供的所述的扩增试剂包含了如PCR或NASBA扩增所需的具有逆转录酶活性的酶。当然试剂盒包含了一种检测基因产物而非核酸的方式，在此还提供了本发明的方法的用途。
此外，本发明还提供了可依据本发明方法获得或检测的化合物在制备药物、除草剂、杀虫剂、抗寄生虫药物、增殖抑制剂等中的用途以及可依据本发明方法获得、衍生或鉴定的药物、除草剂、杀虫剂、抗寄生虫药物等。
在详细的说明书中对本发明进行了更进一步的解释，其中大多数实施例是由测试线粒体这一细胞中的能量供应和使用中心的例子指示的。不过，很容易理解这一原理在检测其他内共生细胞器如叶绿体(植物细胞的碳水化合物供应中心)时也是一样的。
实施例所用的成分和一般方法表1中总结了实施例中用到的引物和探针。标准的NASBA核酸扩增反应反应体积为20μl、反应体系包括40mM Tris-pH8.5、70mMKCl、12mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、1mM dNTP(每种)、2mMrNTP(每种)、0.2μM引物(每种)、0.05μM分子信号、375mM山梨醇，0.105μg/μl牛血清白蛋白，6.4单位的AMV RT、32单位的T7 RNA聚合酶，0.08单位的RNAse H和加入的核酸。除了酶、山梨醇和/或牛血清白蛋白之外其它的混合之后，在加入到酶混合物之前先在65℃加热2分钟，以使RNA中的二级结构变性，引物与模板退火。把混合物冷却到41℃，然后加入酶。在一种荧光计(CytoFluor2000)中41℃扩增90min，而且测定每分钟的荧光信号(用滤光片组在530/25nm和485/30nm测定)。如果扩增DNA靶序列，则把变性温度改为95℃，变性时间从2min变为5min。
为了实现量化，一系列稀释的靶序列用一套特殊的引物扩增，而且反应变为阳性的时间点(检出阳性的时间(TTP))对加入的核酸量绘图。这样就得到了校准曲线，如果输入的核酸量未知，就可根据反应的TTP值从曲线上推知输入量。图1显示了RNA和DNA量化的典型标准曲线的例子。
对一些靶序列来说，没有能确定拷贝数可靠的绝对数量的可用的稀释系列。给出的那些系列是一些测量所得的任意单位而不是DNA或RNA拷贝数如细胞等效的或者ET-单位。结果有时与我们期望的相反，好象RNA少于DNA。
细胞(成纤维细胞和PBMC)在本领域人员所熟知的标准培养基中按标准的方法进行培养，并按实施例中所定义的加入药物或可能有毒性或刺激作用的化合物。按Boom等人所描述的方法从细胞中分离核酸(Boom R、Sol C J、Salimans M M、Jansen C L、Wertheim-van DillenP M、van der Noordaa J、1990.Rapid and simple method for purificationof nucleic acids.J Clin Microbiol；28(3)495-503)或者用从Qiagen(Qiagen GmbH、Max Volmer Strasse 4、40724 Hilden、Germany)购买的分离专用试剂盒，按制造者的操作手册进行核酸的分离。取少量的分离的核酸液体用琼脂糖凝胶电泳分析，剩余的储存在-80℃，以待进一步的分析所用。通常核酸用水稀释10倍后取5μl用于NASBA扩增反应。
实施例1
在这一实施例中，说明了根据本发明中的方法可以测量哪种比率以及这些比率在诊断上的意义例如本发明提供了测定细胞器DNA与染色体DNA相对比率的方法。当这个比率与正常值相比或至少在两个时间点测定了这个比率时，那这个比率就表明每个细胞中细胞器的减少或增加。本发明也提供了确定细胞器RNA与染色体编码的RNA比率的方法。当这个比率与正常值相比或至少在两个时间点测定了这个比率时，那这个比率就表明每个细胞中细胞器转录活动的减少或增加，使细胞的活动状态(即转录状态)标准化。
还提供了细胞器RNA与染色体DNA比率的测定方法。当这个比率与正常值相比或至少在两个时间点测定了这个比率时，那这个比率就表明每个细胞中细胞器转录活动的减少或增加。
也提供了细胞器DNA与细胞器RNA比率的测定方法。当这个比率与正常值相比或至少在两个时间点测定了这个比率时，那这个比率就表明每个细胞中细胞器转录活动的减少或增加，显示为了实现某个mRNA(并且从而蛋白)水平而在转录水平进行的调控。
也提供了细胞器DNA与染色体编码的RNA比率的测定方法。当这个比率与正常值相比或至少在两个时间点测定了这个比率时，那这个比率就表明细胞中转录活动的减少或增加，与染色体RNA的转录水平有关，显示了细胞器的活动状态。当测定的染色体RNA编码细胞器蛋白或其它组分时，这种方法格外有用。
实施例2成纤维细胞在体外培养4周，培养基中分别加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别是3μM和30μM。以在细胞培养物加入溴乙锭和细胞培养物中不加药物作为对照。已知溴乙锭可以完全耗尽细胞中的线粒体，所以作为对细胞中的线粒体含量有影响的阳性对照。每隔一星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其线粒体DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探针MtD mb)和染色体DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探针SnrpD mb)的量。在4周的培养时间内，加了AZT、D4T和没有添加物的培养物的线粒体DNA与染色体DNA的比率没有表现出可测量的变化。加了溴乙锭的细胞中线粒体DNA的量如预期的那样降低了。DDC的结果见图2。
图2中的数据清楚地表明每个细胞中线粒体DNA的数量减少了至少2个对数值，因此证明了抗病毒药物DDC的线粒体毒性。
实施例3成纤维细胞在体外培养4周，培养基中分别加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别是3μM和30μM。以在细胞培养物加入溴乙锭和细胞培养物中不加药物作为对照。已知溴乙锭可以完全耗尽细胞中的线粒体，所以作为对细胞中的线粒体含量有影响的阳性对照。每隔一星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其线粒体RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探针MtR mb)和染色体编码的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探针SnrpRmb)。在4周的培养时间内，加了AZT、D4T和没有添加物的培养物的线粒体RNA与染色体RNA的比率没有表现出可测量的变化。如所预期，加了溴乙锭的细胞中线粒体RNA的量降低了。DDC的结果见图3。图3中的数据清楚地表明每个细胞中线粒体RNA的数量减少了至少2个对数值，因此证明了抗病毒药物DDC的线粒体毒性。三周的时间点所对应的比率非常低，推测可能是逸出值(outliermeasurement)。
实施例4成纤维细胞在体外培养4周，培养基中分别加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别是3μM和30μM。以在细胞培养物加入溴乙锭和细胞培养物中不加药物作为对照。已知溴乙锭可以完全耗尽细胞中的线粒体，所以作为对细胞中的线粒体含量有影响的阳性对照。每隔一星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其线粒体RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探针MtR mb)和染色体DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探针SnrpD mb)的量。
在4周的培养时间内，加了AZT、D4T和没有添加物的培养物的线粒体RNA与染色体DNA的比率没有表现出可测量的变化。如预期的那样，加了溴乙锭的细胞中线粒体RNA的量降低了。DDC的结果见图4。
图4中的数据清楚地表明每个细胞中线粒体RNA的数量减少了至少2个对数值，因此证明了抗病毒药物DDC的线粒体毒性。三周的时间点所对应的比率非常低，推测可能是逸出值。
实施例5成纤维细胞在体外培养4周，培养基中分别加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别是3μM和30μM。以在细胞培养物加入溴乙锭和细胞培养物中不加药物作为对照。已知溴乙锭可以完全耗尽细胞中的线粒体，所以作为对细胞中的线粒体含量有影响的阳性对照。每隔一星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其线粒体RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探针MtR mb)和线粒体DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探针MtD mb)的量。
在4周的培养时间内，加了AZT、D4T和没有添加物的培养物的线粒体RNA与线粒体DNA的比率没有表现出可测量的变化。如预期的那样，加了溴乙锭的细胞中线粒体RNA的量降低了。DDC的结果见图5。
图5中的数据清楚地表明每个细胞中线粒体RNA的数量减少了至少2个对数值，因此证明了抗病毒药物DDC的线粒体毒性。三周的时间点所对应的比率非常低，推测可能是逸出值。
实施例6成纤维细胞在体外培养4周，培养基中分别加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别是3μM和30μM。以在细胞培养物加入溴乙锭和细胞培养物中不加药物作为对照。已知溴乙锭可以完全耗尽细胞中的线粒体，所以作为对细胞中的线粒体含量有影响的阳性对照。每隔一个星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其染色体编码的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探针SnrpR mb)和染色体DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探针SnrpD mb)的量。
在4周的培养时间内，加了AZT、D4T和没有添加物的培养物的线粒体RNA与线粒体DNA的比率没有表现出可测量的变化。如预期的那样，加了溴乙锭的细胞中线粒体RNA的量降低了。DDC的结果见图6。
图6中的数据清楚地表明染色体DNA与RNA的比率在4周的培养时间内没有显著的变化。
实施例7成纤维细胞在抗病毒药物DCC存在的条件下体外培养4周，DCC的浓度为30μM。之后细胞在没有DCC的条件下继续培养。在没有DCC的培养期间，12周每隔两个星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其线粒体DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探针MtD mb)和染色体DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探针SnrpD mb)的量。分析结果见图7。
图7的结果清楚地表明当DCC从培养物中移开后，每个细胞中线粒体的量增加2个对数值以上。这个结果说明如果细胞中仍有一些线粒体能在新长出的细胞中重新聚集的话，DDC的毒性效应可以逆转。
实施例8成纤维细胞在抗病毒药物DCC存在的条件下体外培养4周，DCC的浓度为30μM。之后细胞在没有DCC的条件下继续培养。在没有DCC的培养期间，12周每隔两个星期，收获部分细胞并按所述的NASBA操作分析其线粒体RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探针MtR mb)和染色体编码的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探针SnrpR mb)。分析结果如图8所示。
图7的结果清楚地表明当DCC从培养物中移开后，每个细胞中线粒体RNA的量增加2个对数值以上。这个结果说明DDC的毒性效应可以逆转而且通过RNA和随后的蛋白合成线粒体的功能也得到恢复。
实施例9取自健康的供血者的新鲜的外周血单核细胞(PBMC)体外培养5天，培养液中加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别为6μM和60μM。对照是在细胞培养物加入DMSO和不加药物的细胞培养物。DMSO是溶解药物的溶剂的一部分。5天后收集细胞并按所述的NASBA操作分析线粒体DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探针MtD mb)和染色体DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探针SnrpD mb)的量。
在5天的培养时间内，加了AZT、D4T、DMSO和没有添加物的培养物的比率没有表现出可测量的变化。DDC的结果见图9。
图9的结果清楚地表明在5天的培养时间内，每个PBMC的线粒体DNA的量减少1对数值以上。
实施例10取自健康的供血者的新鲜的外周血单核细胞(PBMC)体外培养5天，培养液中加入抗病毒药物DDC、AZT和D4T，每一种两个浓度，分别为6μM和60μM。对照是在细胞培养物加入DMSO和不加药物的细胞培养物。DMSO是溶解药物的溶剂的一部分。5天后收集细胞并按所述的NASBA操作分析线粒体RNA(引物MtR p1和MtR p2以及探针MtR mb)和染色体编码的RNA(引物SnrpR p1和SnrpR p2以及探针SnrpR mb)的量。
在5天的培养时间内，加了AZT、D4T、DMSO和没有添加物的培养物的比率没有表现出可测量的变化。DDC的结果见图10。有趣的是，在5天的培养时间内，在最高的DCC浓度下，图10的结果没有清楚地显示出每个PBMC的线粒体RNA的量有所减少。这与实施例9所示的线粒体DNA的结果相反。可能转录的增加补偿了线粒体DNA的减少，从而维持了线粒体RNA的水平。这个机制延迟了线粒体RNA的减少。
因此，可以说线粒体RNA是线粒体功能当时状态的一种反应，而且线粒体DNA是线粒体功能(不远的)将来会出现的问题的一种前兆，因而线粒体DNA更有预测性。
实施例11用引物和探针Rubisco-DNA p1、Rubisco-DNA p2、Rubisco-DNAMB、Rubisco-RNA p1、Rubisco-RNA p2和Rubisco-RNA-MB(表1)能定量Oryza sativum(水稻)叶绿体的DNA和RNA，而且用引物和探针OryzaDNA p1、OryzaDNA p2、OryzaDNA mb、OryzaRNA p1、OryzaRNA p2、OryzaRNA mb(表1)能测定染色体DNA和RNA的比率。在应用除草剂(或其它)化合物时，可以用PCR和NASBA这样的本领域人员熟知的扩增方法测定细胞叶绿体核酸的含量来评估植物的情况。同时，使用草特异的一套引物可以监测不必要的植物的破坏情况。显然这些分子工具对于研究新的除草剂特别是只特异地攻击一种植物而对其它没有损害的除草剂非常适合。
实施例12
在这一实施例中，DNA靶序列的NASBA核酸扩增反应的反应体积为20μl，并且反应体系还包括40mM Tris-pH8.5、70mM KCl、12mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇、1mM dNTP(每种)、2mM rNTP(每种)、0.2μM引物(每种)、0.05μM分子信号、1.5单位限制性内切酶MspI、375mM山梨醇，0.105μg/μl牛血清白蛋白、6.4单位AMV RT、32单位T7 RNA聚合酶、0.08单位RNAse H以及加入的核酸。除了酶、山梨醇和/或牛血清白蛋白之外其它的混合之后，在加入到酶混合物之前先在37℃孵育25min，随后95℃变性2min，以使DNA变性从而可使引物与模板退火。把混合物冷却到41℃，然后加入酶。在一种荧光计(CytoFluor 2000)中41℃扩增90min，而且测定每分钟的荧光信号(用滤光片组在530/25nm和485/30nm出测定)。如果扩增DNA靶序列，则把变性温度改为95℃，变性时间从2min变为5min。为了实现量化，用一套特定的引物扩增一系列稀释的靶序列，而且反应变为阳性的时间点(检出阳性的时间(TTP))对加入的核酸量绘图。这样就得到了校准曲线，如果输入的核酸量未知，就可根据反应的TTP值从曲线上推知输入量。图1显示了RNA和DNA量化的典型标准曲线的例子。为了定量，系列稀释的靶序列用特异的引物组扩增而且用反应到达阳性的时间点(检出阳性的时间(TTP))与输入的核酸量作图。来自健康供血者的新鲜的外周血单核细胞(PBMC)体外培养5天。5天后收集细胞并用“所用成分与一般方法”部分中描述的NASBA方法来分析染色体DNA(引物SnrpDp1和SnrpD2 p2以及探针SnrpD mb)的量，并与这个例子中的NASBA方法所得的结果进行比较如图11中可以清楚地看到的那样，在DNANASBA反应前用内切酶进行预处理比没有处理的效果好得多。其原理是从p1引物的T7启动子部分产生的MspI的直接延伸。
实施例13用引物和探针tRNA-L-D p1、tRNA-L-D p2、tRNA-L-D MB、petBRNA p1、petB RNA p2和petB RNA MB(表1)能定量Oryza sativum(水稻)的叶绿体DNA和RNA，而且用引物和探针OryzaDNA p1、OryzaDNA p2、OryzaDNA mb、OryzaRNA p1、OryzaRNA p2、OryzaRNA mb(表1)能测定染色体DNA和RNA的比率。在应用除草剂(或其它)化合物时，可以用PCR和NASBA这样的本领域人员熟知的扩增方法测定细胞叶绿体核酸的含量来评估植物的情况。同时，使用草特异的一套引物可以检测不必要的植物的破坏情况。显然这些分子工具对于研究新的除草剂特别是只特异地攻击一种植物而对其它没有损害的除草剂非常适合。
实施例14包含Snrp DNA的上千个质粒与4×105、2×105、105、5×104、2.5×104或104包含线粒体DNA的质粒分子混合，并作为反应的输入核酸。反应体系与实施例12中的相似，只是用来在一管中扩增Snrp-核和线粒体DNA的引物和信号有所不同。反应混合物(二重混合)包括了两套引物和信号SnrpD p1和SnrpD p2、MtD p1-2和MtD p2-2(每种0.2μM)以及信号SnrpD mb(ROX-标记)和MtD mb-2(FAM-标记)(每种0.05μM)。限制性酶消化，扩增和检测与实施例12中的相同。荧光计的滤光片组(CytoFluor 2000)适于同时检测FAM和ROX-标记(FAM在485/20和530/25nm处；ROX是590/20和645/40nm)。在两个竞争性扩增的同步反应中，对应时间的荧光曲线的斜率与每个扩增的物种中分子的数量成比例(见图12)。
实施例15分别在没有和加入了5μM DDC的条件下培养PBMC。培养5天后取样。按照Boom等人的方法从105个PBMC细胞中分离核酸，并用50μl不含有DNAse和RNAse的水溶解。然后分别稀释10倍和100倍，并从中各取5μl稀释液(分别相当于1000个或者100个PBMC细胞)加到反应混合物中去扩增特异的靶核酸。同样的，包含SnrpDNA的103个质粒分子与包含线粒体DNA的4×105、2×105、105或5×104个质粒分子混合，然后加到反应混合物中。反应体系与实施例12中的相似，只是用来在一管中扩增Snrp-核和线粒体DNA的引物和信号有所不同。反应混合物(二重混合)包括了两套引物和信号SnrpD p1和SnrpD p2、MtD p1-2和MtD p2-2(每种0.2μM)以及信号SnrpD mb(ROX-标记)和MtD mb-2(FAM-标记)(每种0.05μM)。限制性酶消化，扩增和检测与实施例12中的相同。荧光计的滤光片组(CytoFluor 2000)适于同时检测FAM和ROX-标记(FAM在485/20和530/25nm处；ROX是在590/20和645/40nm)。在两个竞争性扩增的同步反应中，对应时间的荧光曲线的斜率与每种扩增的物种中分子的数量成比例。质粒Snrp/线粒体DNA混合物的数据用来做标准曲线，从曲线上可以估计存在和不存在5μM ddC条件下的PBMC样品稀释10倍和100倍后，其中线粒体与Snrp核DNA的比率(见图13)。
实施例16从一个死于重症乳酸性酸中毒的HIV-1感染的病人的血中抽取了4个血液样品，并分析了其外周血单核细胞(PBMC)中的线粒体含量。样品1取自病人死前1年，样品2取自死前3个月，样品3取自死前1.5个月，而样品4则是在病人刚刚死去的时候取的。用Ficoll-Isopaque纯化方法从血中制备外周血单核细胞(PBMC)。用加了5％DMSO的培养液冻存PBMC细胞，并保存在液氮中。用Boom的方法从10PBMC中提取核酸。相当于105个PBMC细胞的核酸用作测定线粒体DNA(引物MtD p1和MtD p2以及探针MtD mb)和染色体DNA(引物SnrpD p1和SnrpD p2以及探针SnrpD mb)的NASBA的输入核酸。引物和探针序列见表1。这个分析的结果表示为每个染色体DNA拷贝的线粒体DNA拷贝数(见图14)。这一实验的结果表示为每个染色体DNA拷贝的线粒体DNA拷贝数(见图14)。
实施例17本实施例中分析了质粒中的线粒体和染色体DNA靶序列的不同比率包括了2×103U1a DNA/8×103Mt DNA、2×103U1a DNA/2×104MtDNA、2×103U1aDNA/4×104MtDNA、2×103U1aDNA/105MtDNA、2×103U1a DNA/2×105Mt DNA、2×103U1a DNA/4×105Mt DNA和2×103U1a DNA/8×105MtDNA分子。反应混合体系的制备与实施例12中的相似，只是在同一管中扩增染色体和线粒体DNA所用的引物和信号不同。反应混合物(二重混合)包含两套引物和信号SnrpD P1和SnrpD2 P2(第一套引物，每种0.2μM)、MtD P1-2和MtD P2-2(第二套引物，每种0.3μM)、以及SnrpD mb-2(FAM-标记的)和MtD mb-3(ROX-标记的)(每种0.04μM)。引物和信号序列见表1。限制性酶消化、扩增和检测与实施例12中的相同。荧光计的滤光片组(CytoFluor2000)适于同时检测FAM和ROX-标记(FAM在485/20和530/25nm处；ROX是在590/20和645/40nm)。在两个竞争性扩增的同步反应中，对应时间的荧光曲线的斜率与每个扩增的物种中分子的数量成比例。结果见图16。FAM和ROX信号的斜率系数之间的关系与输入的线粒体DNA和染色体DNA的比率呈线相关。可以把这个结果作成校准曲线，然后用这个标准的校准曲线计算每个细胞内线粒体DNA的拷贝数。
实施例18成纤维细胞在抗病毒药物DDC(30μM)存在的条件下培养4周，之后分别在有和没有DDC的条件下再继续培养6周。在培养时间内，收集部分细胞并用本领域人员熟知的标准方法来分析乳酸-丙酮酸的比率。乳酸-丙酮酸比率的测定结果见图17。
图17中的数据清楚地表明DCC存在时，乳酸-丙酮酸的比率增加，不过只有在培养4周以后才观察到非常明显的增加。在存在DCC的继续培养中细胞的乳酸-丙酮酸的比率保持高水平，而在培养4周后不再加入DCC的培养中乳酸-丙酮酸的比率降到了正常水平。
而且，我们还测定了与实施例17相同的样品中线粒体DNA和染色体DNA的比率。结果如图18所示。
图18中的数据清楚地说明在DCC存在时，成纤维细胞的线粒体DNA丢失(顶部图示中黑线的逐渐降低)。在DCC存在的条件下培养，两周后就已经观察到线粒体含量的明显降低，而在三周后几乎见不到任何线粒体DNA了。与这些数据不同，传统的乳酸-丙酮酸测定方法只有在四周后才能检测到明显的变化。这些结果清楚地表明测量线粒体DNA的含量能及时预言性地评价其对功能的影响。
在DDC存在的条件下继续培养时，线粒体DNA的量保持在非常低的水平上(底部左边的两个图示)。而在没有DDC的条件下继续培养时，成纤维细胞中线粒体DNA的量出现了明显的反弹(底部右边的两个图示)。
实施例19PBMC在有抗病毒药物DDC(5μM)存在的条件下培养11天，而且以相应浓度的药物溶剂(DMSO)作为对照。在培养期间，每两天就收集部分细胞并按实施例17所描述的那样分析线粒体DNA和U1a DNA的比率。结果见图19。
这个实验的数据清楚地表明DCC存在情况下培养的PBMC细胞中线粒体DNA的含量迅速降低。与对照相比，DCC存在情况下培养的第二天PBMC细胞中线粒体DNA的含量就降到了20％。DCC存在情况下培养的第11天PBMC中线粒体DNA的拷贝数进一步降低至检测不到的水平。
实施例2048名HIV-1感染的病人分别使用AZT、AZT+ddI或AZT+ddC随机的进行抗病毒治疗。在治疗开始后0、4、24和48周抽取血样。用Ficoll-Isopaque纯化方法从血中制备外周血单核细胞。用加了5％DMSO的培养液冻存PBMC细胞，并在使用之前保存在液氮中。
用Boom的方法从105个PBMC提取核酸。相当于1,000个PBMC的核酸按实施例17所描述的方法进行单管实时二重NASBA，来测定线粒体和染色体DNA。分析结果表示为病人样品中单个细胞(即PBMC)中线粒体的含量。表2对结果进行了小结。
治疗开始时病人PBMC的mtDNA含量与治疗4、24和48周的mtDNA含量比较并分析有统计学意义的变化(见表3和图20和21)。这些数据清楚的表明进行AZT+ddI或ddC治疗的病人的PBMC的线粒体DNA含量有明显的减少。
实施例21本实施例中分析了质粒中的线粒体RNA和染色体DNA靶序列的不同比率包括了2×103U1a DNA/5×104Mt RNA、2×103U1aDNA/2.5×105Mt RNA、2×103U1a DNA/5×105Mt RNA、2×103U1aDNA/2.5×106Mt RNA、2×103U1a DNA/5×106Mt RNA、2×103U1aDNA/107Mt RNA、2×103U1a DNA/2.5×107Mt RNA分子。反应混合体系的制备与实施例12中的相似，只是在同一管中扩增染色体DNA和线粒体RNA所用的引物和信号不同。反应混合物(二重混合)包含两套引物和信号SnrpD P1和SnrpD2 P2(第一套引物，每种0.2μM)、MtR P1-2和MtR P2-2(第二套引物，每种0.3μM)，以及SnrpD mb-2(FAM-标记的)和MtR mb-3(ROX-标记的)(每种0.04μM)。引物和信号序列见表1。限制性酶消化、扩增和检测与实施例12中的相同。荧光计的滤光片组(CytoFluor 2000)适于同时检测FAM和ROX-标记(FAM在485/20和530/25nm处；ROX是在590/20和645/40nm)。在两个竞争性扩增的同步反应中，对应时间的荧光曲线的斜率与每个扩增的物种中分子的数量成比例。结果见图22。FAM和ROX信号的斜率系数之间的关系与输入的线粒体RNA和染色体DNA的比率呈线相关。可以把这个结果作成校准曲线，然后用这个标准的校准曲线计算每个细胞内线粒体DNA的拷贝数。
实施例22
成纤维细胞在抗病毒药物DDC(30μM)存在的条件下培养8周，之后分别在有和没有DDC的条件下再继续培养8周。在这段培养时间内，在不同的时间点收集部分细胞并用实施例21中所描述的方法来分析线粒体RNA和染色体DNA的比率。结果见图23。
图23的数据清楚地表明在DDC存在的条件下继续培养时，成纤维细胞的线粒体RNA丢失，在DCC存在时，线粒体RNA保持一种非常低的量。而在没有DDC的条件下继续培养时，成纤维细胞中线粒体RNA的量出现了明显的反弹(时间点为10、12、14和16周)。
实施例23分析用抗病毒疗法(AZT+ddI)进行治疗的2名HIV-1感染的病人(病人1和2)PBMC中线粒体RNA的含量。在治疗开始后0、4、24和48周抽取血样。用Ficoll-Isopaque纯化方法从血中制备外周血单核细胞。用加了5％DMSO的培养液冻存PBMC细胞，并在使用前保存在液氮中。
用Boom的方法从105个PBMC细胞中提取核酸。用相当于1,000个PBMC的核酸按实施例21所描述的方法进行单管实时二重NASBA，来测定线粒体RNA和染色体DNA。测定的结果表示为每个细胞中的线粒体RNA(即PBMC)的含量。表4对结果进行了小结。
在这项研究中病人1和2经过治疗(药物和剂量)后，病人PBMC中的线粒体RNA含量似乎没有明显变化。目前的研究将包含更多的个体和不同的疗法以便对包括核苷类似物在内的治疗所带来的线粒体RNA的变化有一种更好的评价。
表1.实施例中使用的引物和探针


1引物P1序列中的T7启动子部分以斜体字表示，分子信号探针的主体序列用粗体表示。分子信号序列的3′末端用DABCYL(淬灭剂)标记，5′末端用6-FAM(荧光标记)标记。
表2.用不同的治疗方案连续治疗48周的病人PBMC中线粒体DNA的含量

表3.执行不同治疗方案的病人PBMC中线粒体DNA含量显著变化的分析

表4用不同的治疗方案连续治疗48周的病人PBMC中线粒体RNA的含量

表5 HIV-1抑制剂核苷和核苷类似物的线粒体毒性摘自A.Carr，D A Cooper.Lancet 2000；356；1423-1430



图1.DNA和RNA靶序列标准曲线的实施例。
图2.DDC存在条件下培养的成纤维细胞中线粒体DNA和染色体DNA的比率。
图3.DDC存在条件下培养的成纤维细胞中线粒体RNA和染色体编码RNA的比率。
图4.DDC存在条件下培养的成纤维细胞中线粒体RNA和染色体DNA的比率。
图5.DDC存在条件下培养的成纤维细胞中线粒体RNA和线粒体DNA的比率。
图6.DDC存在条件下培养的成纤维细胞中染色体编码RNA和染色体DNA的比率。
图7.DDC存在条件下培养4周后去掉DDC继续培养的成纤维细胞中线粒体DNA和染色体DNA的比率。
图8.DDC存在条件下培养4周后去掉DDC继续培养的成纤维细胞中线粒体RNA和染色体编码RNA的比率。
图9.DDC存在条件下培养5天的PBMC中线粒体DNA和染色体DNA的比率。
图10.DDC存在条件下培养5天的PBMC中线粒体RNA和染色体编码RNA的比率。
图11.加与不加限制性酶MspI预处理的SNRNP DNA NASBA反应的比较。
图12.包含Snrp DNA的1000个质粒分子与4×105(A)、2×105(B)、105(C)、5×104(D)、2.5×104(E)或104(F)个带有线粒体DNA的质粒分子混合后不同反应时间点的荧光。以扩增的线粒体DNA分子与Snrp核DNA量的比率和相应时间的荧光斜率比率绘制曲线(G)。
图13.包含Snrp DNA的1000个质粒分子与4×105(A)、2×105(B)、105(C)、5×104(D)个带有线粒体DNA的质粒分子混合后不同反应时间点的荧光。以扩增的线粒体DNA分子与Snrp核DNA量的比率和来源于图A-D的相应时间点的荧光斜率比率绘制标准曲线(E)。F、G为没有ddC的条件下培养的PBMC细胞稀释10倍或100倍对应的点；H、I则是在5μM ddC存在下培养的PBMC稀释10倍或100倍对应的点。在图E中，正方形代表没有ddC情况下培养的PBMC样品，而菱形表示有5μM ddC存在下的PBMC样品。
图14.死于乳酸性酸中毒的HIV-1感染病人的四个PBMC血样中每个染色体DNA拷贝中的线粒体DNA拷贝数。对时间点的进一步解释见说明书。
图15A.HIV-1感染个体的CD4阳性细胞数和HIV-1 RNA拷贝数。X轴下方标记了ddC和AZT的柱形表示用这些药物治疗的时间段。X-轴下面的4个箭头表示分析PBMC样品中线粒体DNA含量和乳酸-丙酮酸比率的时间点。在时间点4之后大约1个月病人死于乳酸性酸中毒。
图15B.左边的柱形图显示了PBMC样品1到4的乳酸-丙酮酸比率。这些PBMC中没有检测到乳酸-丙酮酸比率的增加。右边的柱形图表明了PBMC样品1到4的线粒体DNA含量。在这个实验中可以观察到线粒体DNA的含量有明显的降低。
图16.使用线粒体DNA与染色体DNA的不同比率作为输入值的ROX的荧光值(染色体DNA，灰线)和FAM荧光信号(线粒体DNA，黑线)。下部的图显示的是信号比率与RNA和DNA比率的线性关系。
图17.成纤维细胞在ddC存在条件下培养4周后，分别在ddC存在和不存在的条件下继续培养所测得的乳酸-丙酮酸比率。
图18.ddC存在条件下培养的成纤维细胞的ROX荧光值(染色体DNA，灰线)和FAM荧光信号(线粒体DNA，黑线)。下面的图显示的是信号比率与RNA和DNA比率的线性关系。上部的图从左向右为ddC存在下分别培养1、2、3和4周的结果。底部左侧的两个图为ddC存在下分别培养7周和10周的结果。而底部右侧的两个图是在没有ddC的条件下继续培养7周和10周的结果。
图19.柱形图表示了ddC不存在(点状柱)和存在(条形柱)条件下培养的PBMC中的线粒体百分比。每个时间点处对照(DMSO)的线粒体DNA量设定为100％。
图20.分别用AZT、AZT+ddI和AZT+ddC治疗的8个病人小组中的线粒体DNA含量的降低。柱上的P显示了与时间点零即治疗开始的时间相比线粒体DNA含量的重大变化。
图21.分别用AZT、AZT+ddI和AZT+ddC治疗的3个病人中的线粒体DNA含量。
图22.使用线粒体RNA与染色体DNA的不同比率作为输入值的ROX的荧光值(染色体DNA，灰线)和FAM荧光信号(线粒体RNA，黑线)。下面的图显示的是信号比率与RNA和DNA比率的线性关系。
图23.柱形图表示了成纤维细胞在ddC存在条件下培养8周后，分别在ddC存在和不存在的条件下继续培养到16周所测得的线粒体RNA的量。
图24.因为副作用而改变抗逆转录病毒治疗的病人的ATHENA研究。
图25.DNA-NASBA扩增图示。
图26.线粒体DNA遗传图谱中的两个区域显示了表1中所示的部分扩增引物的位置。表1中其它的扩增引物位于线粒体基因组的其它区域，没有在图中显示。
参考文献1.Saiki RK、Gelfand DH、Stoffel S、Scharf SJ、Higuchi R、HornGT、Mullis KB、Erlich HA使用耐热DNA聚合酶进行引物指导的DNA酶性扩增.Science 239487-491、19882.Van Gemen B、van Beuningen R、Nabbe A、Van Strijp D、Jurriaans S、Lens P、Kievits T使用电化学发光(ECL)标记的探针进行单试管定量性HIV-1 RNA NASBA核酸扩增分析.J.Virol.Methods 49157-167、19943.Heid CA、Stevens J、Livak KJ、Williams PM实时定量PCR.Genome Res.6986-994、19964.Tyagi S、Kramer FR分子信号杂交后发光的探针.Nat.Biotechnol.14303-308、19965.Leone G、van Schijndel H、Van Gemen B、Kramer FR、SchoenCD分子信号探针结合NASBA扩增对RNA进行同源实时测定.Nucleic Acide Res.262150-2155 19986.Piatak M、Luk KC、Williams B、Lifson JD用于精确定量HIV DNA和RNA的定量竞争PCR.Biotechniques 1470-81、19937.De Baar、MP、van Dooren、MW、de Rooij、E、Bakker、M、Van Gemen、B、Goudsmit、J、and de Ronde、A.单一快速实时监测等温RNA扩增分析法以定量分析来自M、N和O组的HIV-1提取物.J.Clin.Microbiol.39(4)1378-1384、20018.Boom R、Sol CJ、Salimans MM、Jansen CL、Wertheim-vanKillen PM、van der NJ核酸纯化的快速简单方法.J.Clin.Microbiol.28495-503、1990
权利要求
1.测定细胞生物体功能的方法，其包含测定来源于所述生物体的样品中的第一种内共生细胞器核酸和/或其基因产物与第二种核酸和/或其基因产物的量的相对比率。
2.权利要求1的方法，其中测定第一种内共生细胞器核酸和/或其基因产物与在所述样品中可检测到的一种细胞核核酸和/或其基因产物的量的相对比率。
3.权利要求2的方法，其中所述的细胞核核酸包含DNA。
4.权利要求3的方法，其中所述的细胞核核酸包含编码小核糖体核蛋白组分或其片段的DNA。
5.权利要求2的方法，其中所述的细胞核核酸包含RNA。
6.权利要求5的方法，其中所述的细胞核核酸包含编码小核糖体核蛋白组分或其片段的RNA。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述的内共生细胞器核酸和/或其基因产物包含RNA。
8.权利要求1的方法，其中测定第一种内共生细胞器核酸和/或其基因产物与在所述样品中可检测到的第二种内共生细胞器核酸和/或其基因产物的量的相对比率。
9.权利要求8的方法，其中所述的第一种核酸包含DNA。
10.权利要求8的方法，其中所述的第一种核酸包含RNA。
11.权利要求1、2或8中任一项的方法，其中所述的第一种核酸包含DNA，且所述的第二种核酸包含RNA。
12.权利要求11的方法，其中所述的第二种核酸基本上由所述的第一种核酸转录得到。
13.权利要求8到11中任一项的方法，其中所述的第一种内共生细胞器核酸和所述的第二种内共生细胞器核酸来自同一种细胞器。
14.权利要求1或2的方法，其中所述的第一种核酸包含RNA，第二种核酸包含DNA。
15.确定疾病分期的方法，其包含测定从患有所述疾病或具有患有所述疾病的风险的生物体中所取的样品中的内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率。
16.确定用于治疗一种细胞生物体功能障碍的候选化合物的治疗活性和/或可能的副作用的方法，其包含测定来源于所述生物体的样品中的内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率。
17.确定一种药物的治疗活性和/或可能的副作用的方法，其包含测定来源于一种生物体的样品中的内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率。
18.权利要求17的方法，其中所述的药物至少使用了3个月。
19.权利要求17或18的方法，其中所述的药物用来治疗慢性疾病。
20.权利要求16到19中任一项的方法，其中所述的副作用在使用所述的方法时基本上不出现。
21.权利要求16到20中任一项的方法，其中所述的治疗活性包含针对HIV相关疾病和/或肿瘤相关疾病的治疗活性。
22.权利要求16到21中任一项的方法，其中所述的化合物或药物包含核苷和/或核苷酸类似物。
23.权利要求22的方法，其中所述的核苷和/或核苷酸类似物包含氟达拉滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和/或gemeytabine。
24.权利要求16到23中任一项的方法，其中所述的化合物或药物包含AZT、ddI、ddC、d4T、3TC和/或替诺福韦。
25.权利要求16到24中任一项的方法，其中所述的生物体或一基本上相关的生物体已经使用了所述的化合物或药物。
26.测定引起细胞生物体功能障碍的候选化合物的毒性的方法，其包含测定来源于所述生物体的样品中的内共生细胞器核酸和/或其基因产物的相对比率。
27.权利要求26的方法，其中所述的生物体或一基本上相关的生物体已经使用了所述的化合物。
28.测定候选化合物对第一种生物体的选择性活性的方法，其包含按权利要求16或20-25中任一项的方法测定候选化合物的治疗活性和/或可能的副作用和/或按权利要求26或27的方法测定候选化合物的毒性。
29.权利要求28的方法，其进一步包含为基本上无关的第二种生物体提供所述的化合物。
30.权利要求29的方法，其中所述的第一种生物体包含病原体，而所述的第二种生物体包含所述病原体的宿主。
31.权利要求29的方法，其中所述的第一种生物体包含杂草植物，而所述的第二种生物体包含农作物。
32.权利要求1到31中任一项的方法，其中所述的相对比率在同一个实验中测定。
33.权利要求32的方法，其包含在同一个实验中对所述的内共生细胞器的核酸和所述的第二种核酸进行扩增。
34.权利要求32或33的方法，其中所述的相对比率由核酸的一个量除以另一个量直接测定。
35.权利要求1到34中任一项的方法，其中所述的相对比率通过与参考曲线比较来确定。
36.权利要求1到35中任一项的方法，其中所述的内共生细胞器核酸、所述的其基因产物、所述的第二种核酸和/或其基因产物都来自外周血单核细胞和/或成纤维细胞。
37.一种诊断试剂盒，其包含至少一种进行权利要求1到36中任一项的方法的手段。
38.权利要求37的试剂盒，其包含至少一种用于选择性扩增并检测与内共生细胞器相关的或来源于其的核酸的引物或探针。
39.权利要求38的试剂盒，其中所述的至少一种引物或探针列在表1中。
40.按权利要求16或20-36中任一项的方法可得到的或可选择出的化合物在制备药物、除草剂、杀虫剂、抗寄生虫药物、细胞增殖抑制剂或细胞毒性制剂中的用途。
41.按权利要求16或20-36中任一项的方法可得到的或可选择出的药物、除草剂、杀虫剂、抗寄生虫药物、细胞增殖抑制剂或细胞毒性制剂。
全文摘要
本发明涉及疾病的诊断或细胞生物体的功能测定，所述的细胞生物体可以是多细胞的或者单细胞的，可以是肉眼可见的生物体或微生物。本发明提供了一种测定细胞生物体功能的方法，该方法包含测定来源于所述生物体的样品中的第一种内共生细胞器核酸和/或其基因产物与第二种核酸和/或其基因产物的量的相对比率。
文档编号C12Q1/02GK1526022SQ01822477
公开日2004年9月1日 申请日期2001年12月4日 优先权日2000年12月4日
发明者鲍勃·范格曼, 鲍勃 范格曼, 凯瑟琳娜 安娜 克拉西娜 蒂默曼斯, 伊夫琳·凯瑟琳娜·安娜·克拉西娜·蒂默曼斯, 德龙德, 安东尼·德龙德, 约翰娜 莫尼卡 多伯拉尔, 伊雷妮·约翰娜·莫尼卡·多伯拉尔 申请人:普里马根公司