专利名称：能在大肠杆菌中全长表达的丙型肝炎病毒被膜蛋白e2基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种能在大肠杆菌中全长表达的丙型肝炎病毒被膜蛋白E2基因，及其编码蛋白和其在制备诊断、预防和治疗丙型肝炎的药物中的应用。
现有研究表明，HCV为正链RNA病毒，基因组全长约10,000个核苷酸，仅含单一阅读框架，编码一个3,000个氨基酸的多蛋白。通过与其它同属的病毒比较，两个糖基化的被膜蛋白E1和E2被认为位于病毒颗粒的表面。某些种类病毒的被膜蛋白所激起的免疫反应能产生中和性抗体并能有效地清除病毒。
由于HCV在患者血液中滴度很低，目前还缺乏有效的体外增殖的方法，不能直接对病毒进行研究，因而只能通过体外翻译系统、各种基因重组表达系统，如大肠杆菌、昆虫病毒、哺乳动物细胞以及痘苗病毒等系统表达HCV的蛋白。
HCV被膜蛋白(E1、E2)被认为含有主要免疫决定簇，特别是其中的E2，因而研究被膜蛋白E2在HCV分子病毒学、发展疫苗等研究中无疑具有重要的意义。
HCV E2编码第384-746位氨基酸，并含有两个高变区HVR1(编码第386-411位)和HVR2(编码第470-480位)(Hijikata M等人Biochem.Biophys.Res.Commun.1991 175220-228；Weiner AJ等人Virology 1991 180842-848)。E2的羧端区域具强疏水性(编码662-746位)，并含有跨膜区(TMD，transmembranedomain)编码第718-746位，含有E2在内质网体系中的滞留信号(Duret S等人J.Biol.Chem.1998 27332088-32095；Cocquerel L等人J.Virol.1998722183-2193)。E2在酵母表达系统(Mustlli AC等人Res.Microbiol.1999150179-187)、在昆虫病毒表达系统(Hüssy R等人Virus Research 1996 4545-57)、在哺乳动物细胞表达系统(Rosa D等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996931759-1763)、在重组痘苗表达系统中(Choo QL等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994 911294-1298)等都实现了表达。
如果去除羧端疏水区后或外加分泌信号，在上述真核表达系统中可实现分泌表达。其表达产物虽然具有糖化加工，可能更接近天然的病毒结构，但因表达量低、纯化困难、成本高等因素，要获得大量的HCV E2蛋白仍有一定困难。在大肠杆菌表达系统中，繁殖快、成本低，但由于胞外域羧端强疏水性等可能的原因，始终不能表达HCV全长结构的E2，不能获得全长完整的E2表达蛋白。通常都必须去除羧端的疏水区(662-746位氨基酸)，如仅表达第384-661位氨基酸去除了羧端疏水区的E2蛋白(如Hüssy R等人J.Hepatology 1997 261179-1186，Mita E等人Biochem.Biophy.Res.Commun.1992 183925-930)。未见有单独表达被膜蛋白E2胞外域羧端强疏水区的报道，也未见有成功表达编码全长被膜蛋白E2的报道。
本发明提供了一种能在大肠杆菌中获得全长表达的HCV被膜蛋白E2基因，其核甘酸序列见序列表中的<210>1，它在1b亚型HCV被膜蛋白E2基因中胞外域羧端部分的氨端，即被膜蛋白E2的中央区域，在编码第568位至第571位引入了一个编码4个氨基酸残基的移码突变，也即将原来的氨基酸序列PCNI改换成RVTS的移码突变。含该移码突变的E2胞外域羧端部分(编码567位-730位)和近完整的E2m(编码385-730位)基因[该基因的表达克隆pQE8/E2(385-730)m已转入大肠杆菌TG-1中存放，即TG-1/pQE8E2m，由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，2002年3月4日，保藏编号CGMCC No.0725]，在大肠杆菌表达体系中，突破了原来E2胞外域羧端部分和E2基因不能在大肠杆菌中获得全长表达的限制，能够高效地获得全长E2胞外域羧端部分(567位-730位)或近完整E2蛋白(385位-730位)的表达。该E2蛋白可通过在表达载体上融合有的6xHis序列，方便地利用Ni2+-NTA亲合介质富集和纯化HCV的E2胞外域羧端部分(567位-730位)或近完整的E2蛋白(385位-730位)。全长表达的E2蛋白(其氨基酸序列见序列表中的<210>2)具有良好的E2的抗原性和免疫原性，能与HCV患者血清中存在的E2抗体反应，可应用于对E2抗体的酶联免疫吸附测定。
本发明还提供了该能在大肠杆菌中全长表达的HCV被膜蛋白E2基因的编码蛋白在制备、诊断、预防和治疗丙型肝炎的药物中的应用。
该全长表达的E2蛋白免疫动物(小鼠或家兔)能产生抗E2抗体，制备的多抗血清能与多种不同系统(如重组痘苗病毒，哺乳动物细胞，大肠杆菌等)表达的E2蛋白反应，可用于各个系统中表达E2的检测，如免疫印迹分析等。
本项发明提供了一种条件，即可以单独研究E2胞外域羧端部分或完整地研究HCV E2蛋白性质和HCV E2的分子病毒学，以及开展完整的HCV E2抗原和抗体作用和性质及其应用的研究。
本发明所提供的一个能在大肠杆菌系统中获得全长表达的丙型肝炎病毒近完整被膜蛋白E2的基因或E2基因的胞外域羧端部分及其编码蛋白，该基因中在胞外域羧端疏水区的氨端即完整E2基因的中央区域引入了一个编码4个氨基酸序列的移码突变，具体方法包括1.含有丙型肝炎病毒被膜蛋白E2胞外域羧端部分(567-700)的表达克隆的构建[pQE8/E2(567-700)]；2.在E2胞外域羧端部分(567-700)氨端含有编码4个氨基酸残基移码突变的克隆[pQE8/E2(567-700)m]；3.E2胞外域羧端部分(567-730)氨端含有移码突变的表达克隆的构建[pQE8/E2(567-730)m]；4.完整的含移码突变的HCV被膜蛋白E2基因(编码385-730)表达克隆的构建[pQE8/E2(385-730)m]和不含移码突变的E2基因(编码385-730)的表达克隆的构建[pQE8/e2(385-730)]；5.含HCV完整E2有移码突变的HCV近完整E2(385-730)m在大肠杆菌中全长表达及表达产物性质的鉴定。
本发明的
如下图1是含HCV E2胞外域羧端部分(567-700)表达克隆pQE8/E2(567-700)的构建示意图。
各种符号说明 被膜蛋白E2，标在下方的数字为E2该位置编码氨基酸的序号；A-限制酶ApaI；H-HindIII；B BamHI；S-SmaI；Lig-连接；左侧标示为重组后质粒名称，右侧标注为重组前原始质粒名称；图2是在表达克隆pQE8/E2(567-700)m中E2胞外域羧端部分(567-700)编码第568位到571位氨基酸序列发生移码突变的示意图。
上方数字位E2该位点编码氨基酸的序号P-脯氨酸；C-半胱氨酸；N-天冬酰氨酸；I-异亮氨酸；R-精氨酸；V-缬氨酸；T-苏氨酸；S-丝氨酸；密码子下方画线代表相对已发生移码突变的第568-571位氨基酸残基；图3是含有移码突变的HCV E2胞外域羧端部分(第567-730位)的克隆pQE8/E2(567-730)m构建示意图。
Sp-限制酶SphI；Sa-SalI；H-HindIII；lig-连接。
被膜蛋白E2，标在下方的数字为E2该位置编码氨基酸的序号；左侧标示为重组后质粒名称，右侧标注为重组前原始质粒名称；图4是含有移码突变的HCV近完整E2(385730)m表达克隆pQE8/E2(385-730)m构建示意图。
被膜蛋白E2，标在下方的数字为E2该位置编码氨基酸的序号；P1→，正向引物P1；←P2，反向引物P2；P3→，正向引物P3；←P4，反向引物P4；H-HindIII；B-BamHI；A-ApaI；N-NheI；lig-连接。
左侧标示为重组后质粒名称，右侧标注为重组前原始质粒名称；图5是含E2胞外域羧端部分的表达克隆pQE8/E2(567-700)、pQE8/E2(567-700)m、pQE8/E2(567-730)m的表达产物以及含完整E2的表达克隆pQE8/E2(385-730)与pQE8/E2(385-730)m的表达产物电泳后的考马斯亮蓝染色鉴定。
A-pQE8/E2(567-700)；B-pQE8/E2(567-700)m；C-pQE8/E2(567-730)m；D-pQE8/E2(385-730)；E-pQE8/E2(385-730)m。
图上标示的预计分子量大小A-17.8KD；B-17.8KD；C-23.2KD；D-41.6KD；E-41.6KD；
图6是完整被膜蛋白E2全长表达产物E2(384-730)m的免疫印迹分析，ECL显影照片。
A-HCV感染者血清S94；B-E2多抗血清RE2116；图7是HCV E2全长表达产物E2(384-730)m的Ni柱纯化和电泳后的考马斯亮蓝染色鉴定。
A-纯化前样品；B-纯化后样品；图8是由E2(384-730)m制备的多抗血清能与不同重组表达体系来源的E2特异结合的免疫印迹分析。
A-重组痘苗病毒vv/E2表达的E2；B-大肠杆菌TG-1/pQE8/E2(385-730)m表达的E2。
因在E2基因中第565位原含有ApaI酶切识别位点，以及第700位外在载体上的HindIII识别位点，先用ApaI酶切开后削平，再用HindIII酶解后切下，分出含E2(567-700)片段，插入经SmaI和HindIII双酶解过渡质粒pUC19，构建成pUC19/E2(567-700)，再用BamHI和HindIII回切出E2(567-700)片段，插入经同样酶解的表达载体，其克隆位点氨端含有6xHis(6x组氨酸)标识的pQE8(QIAGEN公司)上的BamHI和HindIII位点，构建成含E2胞外域羧端部分(567-700)的表达克隆pQE8/E2(567-700)。(见图1)。
表达质粒都通过了序列测定(由上海博亚公司完成)。
实施例2 能在大肠杆菌全长表达的HCV E2胞外域羧端部分(567-700)氨端含有移码突变的克隆pQE8/E2(567-700)m。
在实施例1中所构建的含HCV E2胞外域羧端部分(567-700)的克隆pQE8/E2(567-700)在大肠杆菌中不能获得预计全长E2(567-700)的表达(见实施例5图5中A)。在选择中pQE8/E2(567-700)m能在大肠杆菌中获得全长E2(567-700)m的表达(见实施例5，图5中B)。经序列测定后表明在pQE8/E2(567-700)m中E2的氨端编码第567氨基酸残基的密码子第1位缺少了一个C，而在编码第571位氨基酸残基密码子的第3位多出一个G，但并没有改变自571以后的氨基酸顺序，而仅在前4位氨基酸序列发生了移码突变，将原来E2胞外域羧端部分编码第567-571位的氨基酸序列由原来的PCNI改换成RVTS(见图2)。含移码突变的E2基因序列及其相对应的氨基酸序列分别见序列表中的<210>1和<210>2。
实施例3 含移码突变的HCV E2胞外域羧端部分(第567-730位)表达克隆pQE8/E2(567-730)m的构建为将表达的E2胞外域羧端部分的羧末端延长至几近完整的第730位，利用含HCV E2羧端至730位的表达质粒pEH(李迎春等人，中国科学C辑，1998年28(3)，204-210)，先用SalI酶解后补平，再用SphI酶解切出含E2片段插入到在实施例2中所述的pQE8/E2(567-700)m质粒先经HindIII酶解后补平再用SphI酶解分去该片段后的表达载体中，即构建成表达HCV E2胞外域羧端部分(567-730)m的pQE8/E2(567-730)m表达克隆，见图3。
实施例4 含有移码突变的近完整HCV E2(385-730)m表达克隆pQE8/E2(385-730)m的构建为了获得近完整的HCV E2(385-730)的表达克隆，以含完整HCV E2的质粒pEH(李迎春等人，中国科学C辑，1998年28(3)，204-210)为模板，用引入BamHI识别位点正向引物P1 5′-GGGGATCCAACACCTACGTGACGGGG-3′和引入HindIII识别位点的反向引物P2 5′-CTTTTAAGCTTAGGTATGGTGGTG-3′，采用PCR技术扩增出HCV E2(385-730)片段，然后经BamHI和HindIII酶解后插入到先经BamHI和HindIII双酶解后的表达载体pQE8上，构建成表达HCV E2(385-730)的pQE8/E2(385-730)表达克隆(见图4A)。
另外以实施例3所述的表达克隆pQE8/E2(567-730)m为模板，用引入ApaI识别位点的正向引物P3 5′-GTCGGGCCCCCGTGTAACATCG-3′和引入NheI识别位点的反向引物P4 5′-CAAGCTAGCTTGGATTCTCACC-3′，采用PCR技术扩增出含有移码突变的ApaI-NheI片段，再经ApaI和NheI双酶解后插入到先经同样酶切后的，并分去原来的ApaI-NheI片段后的pQE8/E2(385-730)表达质粒，改建成表达HCV近完整E2、其中胞外域羧端部分的氨端含有移码突变的表达克隆pQE8/E2(385-730)m(见图4B)。
实施例5 含E2胞外域羧端部分的表达克隆pQE8/E2(567-700)和E2胞外域羧端部分含移码突变的表达克隆pQE8/E2(567-700)m、pQE8/E2(567-730)m以及含近完整E2的表达克隆pQE8/E2(385-730)和含近完整E2、其中胞外域含移码突变的表达克隆pQE8/E2(385-730)m的表达和表达产物的染色鉴定。
含有各重组质粒的TG-1，经终浓度1mM IPTG诱导培养，收集菌体，再用含8M脲/20mM巯基乙醇的PBS缓冲液(pH8.0)抽提。抽提物在标准的Laemmli(Laemmli K等，Nature 1970；223680)SDS-PAGE电泳后，采用考马斯亮蓝G-250染色，结果见图5。
重组克隆的表达蛋白A，E2(567-700)；B，E2(567-700)m；C，E2(567-730)m及D，E2(385-730)；E，E2(385-730)m由编码氨基酸推测的分子量分别为17.8kDa，17.8kDa，23.2kDa及41.6kDa，41.6kDa。但是含胞外域羧端部分的克隆pQE8/E2(567-700)和完整E2的表达克隆pQE8/E2(385-730)都不能在大肠杆菌中获得预计全长的表达产物或只能获得小于全长表达的产物，见图5中A和D。唯有在E2胞外域羧端部分的氨端含有移码突变的重组E2胞外域羧端部分表达克隆pQE8/E2(567-700)m、pQE8/E2(567-730)m以及胞外域含移码突变的近完整E2的重组表达克隆pQE8/E2(385-730)m才能在大肠杆菌中有全长蛋白的表达，见图5中B、C、E，并分别有和预计的分子量为17.8kDa，23.2kDa及41.6kDa相符的蛋白表达。
实施例6 全长表达的HCV E2(385-730)m其抗原性的免疫印迹分析全长表达的E2(385-730)m经电泳后转移到硝酸纤维素薄膜上(Wattman公司产品)，免疫印迹分析中所用一抗有丙型肝炎患者血清S94(王宇，北京大学医学院提供)或用在大肠杆菌中表达的E2(450-565)蛋白制备的多抗血清RE2116(Liu Jing等人，Biotechnol Appl Biochem 2001；34109-119)，二抗采用辣根过氧化物酶联结合的蛋白A(Sigma公司产品，1∶1000)或猪抗兔Ig的辣根过氧化物酶联结合物(Dako公司产品，1∶1000)，按Amersham公司提供的ECL试剂和方法，产生荧光并压片，结果见图6。结果表明用含有E2抗体的HCV患者血清(图6A)或用表达E2制备的多抗血清(图6B)都能特异地与之结合，并在预计的全长的E2被膜蛋白分子量为41.6kDa处产生特异的条带，这说明在大肠杆菌中表达的E2(385-730)m虽然未经过糖化加工，但仍具有良好的抗原性，能被丙型肝炎患者血清中的E2抗体识别和由E2制备的多抗血清中的E2抗体识别，表达的全长E2(385-730)m具有良好的抗原性。
实施例7 全长表达的HCV E2(385-730)m，用Ni2+-NTA金属螯合亲和层析技术的纯化经IPTG诱导培养的TG-1/pQE8/E2(385-730)m离心收集菌体，悬于含8M脲/20mM巯基乙醇的PBS缓冲液(pH8.0)抽提，离心收集上清，在变性条件下用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶金属螯合亲和介质(QIAGEN公司产品)结合，用含8M脲/20mM巯基乙醇的PBS缓冲液(pH6.3)洗涤，再用含8M脲/20mM巯基乙醇的PBS缓冲液(pH4.3)洗脱、收集，各个样品上样电泳后，并染色，用已知量牛血清白蛋白(BioRad公司)电泳后，用光密度扫描，比较计算蛋白量。纯化结果见图7，其中A为纯化前样品。在变性条件下经一步纯化可得全长表达的E2(385-730)m蛋白占全部表达蛋白的30％以上，收得率为每升培养物最终可得纯化的E2蛋白1mg以上(图7B)。
实施例8 纯化的HCV E2(385-730)m蛋白用于HCV患者血清中E2抗体特异结合的酶联免疫测定(ELISA)利用表达的E2(385-730)m良好抗原性能与血清中E2抗体特异结合的特性，用纯化的E2(385-730)m对临床血清中的E2抗体进行了检测。按每孔包被0.15μg E2(385-730)m，37℃保温1小时后，4℃过夜，用PBS/1％牛血清白蛋白BSA(w/v)/2％灭活的新生牛血清封闭，然后按UBI公司提供的HCVEIA 4.0试剂盒和方法进行。血清1∶20稀释，37℃保温1小时，二抗为UBI提供的羊抗人Ig抗体-辣根过氧化物酶联结合物，1∶150稀释，37℃反应30分钟，邻苯二胺(OPD)显色，492nm测定吸收值。
选用100份健康助血员血清(总抗体阴性)，158份HCV总抗体阳性血清，20份乙型肝炎患者血清和20份非甲-戊型肝炎血清进行了测定，结果见表1。由表1可以看出，用E2(385-730)m包被测定人血清中E2抗体有较好的特异性，20份乙型肝炎患者血清和20份非甲-戊型肝炎患者血清均是阴性。HCV患者总抗体阳性血清中E2抗体的阳性率为56％，健康助血员中有3份检出E2抗体阳性，用免疫印迹分析后确认很可能带有E2抗体。结果表明，用表达的E2(385-730)m包被，用ELISA方法可有效地检出人血清中的E2抗体。
表1利用E2(385-730)m检测人血清中HCV E2抗体所测抗体群体(样本数) HCV总抗体 E2抗体阳性份数 阳性率 阳性份数 阳性率健康助血员(100) 0 0％ 3*3％*乙型肝炎患者(20) 0 0％ 0 0％非甲-戊型肝炎患者(20)0 0％ 0 0％丙型肝炎患者(158)158 100％ 8956％
实施例9 由纯化的HCV E2(385-730)m制备的多抗血清能特异识别不同重组表达来源的E2被膜蛋白选用1-1.5公斤雌性新西兰大耳兔(购自上海实验动物中心)，纯化的E2(385-730)m蛋白先与等体积的佛氏完全佐剂(所有佐剂都为GibcoBRL公司产品)混合后，在颈后皮下注射，每次免疫300μg，4周后加强一次，加强时所用蛋白与等体积的不完全佐剂混合。最后采血制备的抗血清抗体滴度达到3.2×104。多抗血清应用于免疫印迹分析，结果见图8。多抗血清中的E2抗体能与不同重组表达来源的E2——如来自重组痘苗病毒(图8A)以及未经糖化加工的大肠杆菌(图8B)等系统表达的HCV被膜蛋白E2特异的结合。A为含HCV E2(384-730)的重组痘苗病毒感染HeLa细胞的细胞裂解液[见李迎春等人中国科学C辑，1998年28(3)，204-210)]，图中可见重组痘苗病毒系统表达的糖化E2，分子量为55kDa左右。B为含HCV E2(385-730)m的大肠杆菌TG-1表达产物，图中可见E2在大肠杆菌中未经糖化加工的E2(385-730)m分子量为41.6kDa的特异条带。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所<120>能在大肠杆菌中全长表达的丙型肝炎病毒被膜蛋白E2基因及其编码蛋白和应用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1038<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<400>1acc tac gtg acg ggg ggg gcg gct gca cgc ggg gcc tcc ggg atc acg 48agc ctc ttt tca cgt ggt ccg tct cag aaa atc cag ctt gtg aac acc 96aat ggc agc cgg cac atc aac ggg act gcc ctg aac tgc aat gac tcc 144ttc aac act ggg ttc ctc gcc gcg ctg ttc tac gcg cac agg ttc aac 192tcg tcc gga tgc cca gag cgc atg gcc agc tgc cgc tcc att gac aag 240ttc gac cag gga cgg ggt ccc atc act tat tat cag ggt gac agc ccg 288gac cag agg cct tat tgc tgg cac tac cca cct cga ccg tgt ggt ata 336gtg ccc gcg tcg gag gtg tgt ggt cca gtg tat tgt ttc acc cca agc 384ccc gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgc ctc ggc gtc cct aca tat aac 432tgg ggg gaa aat gag aca gac gtg ctg ctc ctt aac aac acg cgg ccg 480ccg caa ggc aac tgg ttc ggc tgt acg tgg atg aat acc acc ggg ttc 528acc aag acg ttc ggg ggc ccc cgt gta aca tcg ggg ggg gcc ggc aac 576aac acc ttg act tgc ccc acg gac tgc ttc cgg aag cac ccc gag gcc 624act tac aca aaa tgt ggt tcg ggg cct tgg ttg aca cct agg tgc tta 672gtt gac tat cca tac agg ctc tgg cat tac ccc tgc act gtt aac ttc 720acc atc ttt aag gtt agg atg tat gtg ggg ggc gtg gag cac agg ctc 768gac gcc gca tgc aac tgg act cga gga gaa cgt tgc gcc ttg gag gac 816agg gat aga tca gag ctc agc ccg ctg ctg ctg tct aca aca gag tgg 864cag ata ctg ccc tgt tcc ttc acc acc cta ccg gcc ctg tct act ggt 912ttg atc cat ctc cac cgg aac atc gtg gac gtg caa tac cta tac ggt 960ata agg tca gca gtt gtc tcc ttt gcc atc aaa tgg gag tat gtc ctg 1008ttg ctt ttc ctt ctc ctg gca gac gcg cgc 1038<210>2<211>346<212>PRT<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<400>2Thr Tyr Val Thr Gly Gly Ala Ala Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ile Thr1 5 10 15Ser Leu Phe Ser Arg Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr20 25 30Asn Gly Ser Arg His Ile Asn Gly Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser35 40 45Phe Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Arg Phe Asn50 55 60Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys65 70 75 80Phe Asp Gln Gly Arg Gly Pro Ile Thr Tyr Tyr Gln Gly Asp Ser Pro85 90 95Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile100 105 110Val Pro Ala Ser Glu Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser115 120 125Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Leu Gly Val Pro Thr Tyr Asn130 135 140Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Ash Asn Thr Arg Pro145 150 155 160Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Thr Thr Gly Phe165 170 175Thr Lys Thr Phe Gly Gly Pro Arg Val Thr Ser Gly Gly Ala Gly Asn180 185 190Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala195 200 205Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Leu210 215 220Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe225 230 235 240Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu245 250 255Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Ala Leu Glu Asp260 265 270Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp275 280 285Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly290 295 300Leu Ile His Leu His Arg Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly305 310 315 320Ile Arg Ser Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu325 330 335Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg340 34权利要求
1.一种能在大肠杆菌中全长表达的丙型肝炎病毒被膜蛋白E2基因，其核苷酸序列为序列表中的<210>1。
2.一种根据权利要求1所述的E2基因的编码蛋白，其氨基酸序列为序列表中的<210>2。
3.如权利要求2所述的丙型肝炎被膜蛋白E2在制备、诊断、预防和治疗丙型肝炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能在大肠杆菌中全长表达的丙型肝炎病毒被膜蛋白E2基因及其编码蛋白。该全长表达的丙型肝炎病毒被膜蛋白E2具有E2的抗原性和免疫原性，用来免疫动物可产生抗E2的抗体，为研究完整的HCV E2的抗原性和免疫原性创造了条件。经过纯化的近完整的全长E2蛋白和制备的E2抗体，可用于丙型肝炎的诊断、预防和治疗。
文档编号C12N15/70GK1465700SQ02112089
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月14日 优先权日2002年6月14日
发明者李光地, 刘晶, 汪垣 申请人:中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院上海生命科学研究院生物化