专利名称：广谱抗性基因Pi2的克隆与表征的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及植物分子生物学。更具体而言，涉及核酸和调节核酸在植物中表达的方法，以及为了提高抗病性用基因转化植物。
背景技术：
由真菌Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是最具破坏性的水稻病之一，在世界上大多数水稻生长地区都有发生。在植物损害方面，稻瘟病在水稻植物发育的营养阶段通常导致叶枯(leaf blast)，当植物在生殖阶段感染时导致不育(圆锥花序和结节枯萎(panicle and node blast))。后一种影响能够导致产量和质量显著下降，估计造成农民经济损失每年大约50亿美元(Moffat(1994)Science 2651804-1805)。
因为稻农的经济来源通常有限，最常见的是使用显示自然抗病性的水稻植物栽培种实现稻瘟病的控制。然而，这些栽培种显示的抗病性通常不稳定，栽培种显示的抗性只在广泛耕种少数几季后即显示敏感性。尽管具有这种不稳定性，但是使用抗性栽培种仍然是最经济、有效的控制稻瘟病的方法。因此，仍然需要这些抗病栽培种。
尽管抗性栽培种是自然产生的，但是最近的研究集中于产生或改良高抗病性植物的遗传学方法。因此在最近40年，为了发展培育长期抗性栽培种所需的方法，水稻遗传学家和育种家研究了稻瘟病抗性种质的遗传学。稻瘟病抗性的遗传分析方法始于二十世纪六十年代初期，当时Goto为日本的M.grisea种建立了不同的系统(Ou(1985)Rice Disease第二版(Commonwealth Mycological Institute，Slough，UK)。
特别重要的一种稻瘟病抗性基因是Pi2基因，它显示对稻瘟病分离株不同群体的高效广谱抗性，因此在使用十年后，在许多水稻耕种地区仍然有效。尽管该基因在水稻基因组中的位置已经确定(Yu等人(1991)Theor.Appl.Genet.81471-476；Liu等人(2002)Mol.Genet.Genom.267472-480)，但是它的DNA序列仍然不知道。因为产生或提高抗病性的技术依赖于对这些序列的了解，所以非常需要获得Pi2基因的实际DNA序列。
发明概述提供了产生或提高植物害虫抗性的组合物和方法。组合物是从水稻中克隆的新Pi2-样抗病性基因同源物的核苷酸序列，以及它们编码的蛋白质或部分长度蛋白质或多肽的氨基酸序列。本发明的方法包括用这些新抗病性Pi2-样基因同源物之一稳定地转化一种植物，其中该基因与一个能够引导核苷酸编码序列在植物细胞中表达的启动子有效连接。通过与侵入的植物病原体释放到植物内的互补的植物病原体毒力基因产物相互作用，新核苷酸序列的表达使植物具有抗病性。本发明的方法可用于控制植物害虫，包括真菌病原体、病毒、线虫、昆虫等。
另外还提供了转化的植物和种子，以及产生这些植物和种子的方法。
附图简述
图1显示Pi2基因座的物理图谱。TAC和BAC克隆用线条显示。BAC70、TAC40和TAC10克隆用来进行测序。引物NIP、NBS2、NBS4和BAC6F在相应BAC和TAC克隆上的位置在BAC/TAC重叠群上方显示。
图2A、B显示Pi2基因座的遗传和物理图谱。A.在Pi2遗传作图中使用的标记在方框中显示，用箭头与相应的基因组序列相连，相应标记与Pi2之间的遗传距离在标记上方显示。B.Pi2区中的NBS/LRR基因簇。位于NBS/LRR基因簇上游的NIP基因显示为最左边的阴影框。6个NBS/LRR基因(NBS1-NBS6)按照它们在基因组序列中出现的顺序命名，分别显示为图中用NBS1-NBS6标记的6个方框。所有这些基因的转录方向都在基因名称下方用箭头表示。基因NBS1-NBS6的外显子显示为淡影线方框；位于NBS3基因左手部分的深影线方框代表该基因中的反转录子插入。
图3显示克隆NBS2的完整编码序列(CDS)的示意图。
图4显示NBS/LRR基因在Pi9和Pi2基因座处的比对。基因组序列用粗体字符串区别，NBS/LRR基因用实心圆形区别。Pi2与Pi9基因座之间的直向同源基因用双箭头直线表示。
图5显示NBS1、NBS2、NBS4、NBS6和克隆的稻瘟病抗性基因Pib的预测氨基酸序列之间的多重蛋白质序列比对。
图6显示NBS2(Pi2)基因内的保守NB-ARC和LRR结构域。该基因中存在一个NB-ARC结构域，从约氨基酸144到约氨基酸465，而该基因中也存在一个LRR结构，从约氨基酸534到约氨基酸951。
发明详述本发明的组合物包含与抗病性有关的Pi2和相关(Pi2-样)基因。具体而言，本发明提供分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NOs2、4、6、8、10和12所示氨基酸序列的核苷酸序列。还提供具有此处所述(例如SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11所示)核酸分子编码的氨基酸序列的多肽。
本发明公开了NBS1-NBS6的核苷酸序列，分别是SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11。本发明也公开了NBS1-6的相应的氨基酸序列，分别为SEQ ID NOs2、4、6、8、10和12。SEQ ID NO13公开了实施例3获得的Pi2区的99,090bp连续序列。SEQ ID NOs14和15分别对应于实施例6的cDNA-45和cDNA-21；即，对应于NBS4基因的两个部分测序的3′片段，它们延伸超过终止密码子，包含位于NBS4基因3′端侧翼的DNA序列。
本发明包括分离的或者基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物活性部分基本上不含如自然存在环境中可见的，通常与核酸分子或蛋白质伴随或相互作用的成分。因此，一种分离的或纯化的核酸分子或蛋白质基本上不含其它细胞物质，或者当通过重组技术生产时，基本上不含培养基，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学制剂。优选地，一种“分离的”核酸不含在作为该核酸来源的生物基因组DNA中自然位于该核酸侧翼的序列(优选地蛋白质编码序列)(即位于该核酸5’和3’端的序列)。例如，在不同实施方案中，分离的核酸分子可含有不到约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些序列在作为该核酸来源的细胞的基因组DNA中自然位于该核酸分子侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白质包括含有不到约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的污染蛋白质的蛋白质制品。当重组生产本发明的蛋白质或其生物活性部分时，培养基优选地含有不到约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的化学前体或非目标蛋白质的化学制剂。
本发明也包括公开的核苷酸序列和它们编码的蛋白质的片段和变体。“片段”是指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，以及它们编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段，因此提供抗病性。此外，可以用作杂交探针的核苷酸序列的片段通常不编码保留对植物的生物活性的片段蛋白质。因此，一种核苷酸序列的片段可以是至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，和高达编码本发明的蛋白质的全长核苷酸序列。
一种Pi2-样核苷酸序列的片段编码本发明的Pi2-样多肽的生物活性部分，该片段将编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、660、650、700、750、800、850、900、950或1000个连续氨基酸，或者可达本发明的全长Pi2-样蛋白质中所含的全部数量的氨基酸(例如，对于SEQ ID NOs2、4、6、8、10和12分别为993、1032、660、1032、49和998个氨基酸)。可以用作杂交探针或PCR引物的Pi2-样核苷酸序列的片段通常不需要编码一种Pi2-样蛋白质的生物活性部分。
因此，一种Pi2-样核苷酸序列的片段可编码Pi2-样蛋白质的生物活性部分，或者可以是能够在下文公开的方法中作为杂交探针或PCR引物的片段。一种Pi2-样蛋白质的生物活性部分能够如下制备分离本发明的Pi2-样核苷酸序列之一的一部分，表达该Pi2-样蛋白质的编码部分(例如通过体外重组表达)，评价该Pi2-样蛋白质的编码部分的活性。作为一种Pi2-样核苷酸序列的片段的核酸分子至少含有16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1660、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2660、2650、2700、2750、2800、2850、2900、1950、3000或3050个核苷酸，或者高达此处公开的全长Pi2-样核苷酸序列中所含核苷酸的数量(例如，对于SEQ ID NOs1、3、5、7、9和11分别为2982、3099、4147、3099、1389和2997个核苷酸)。
“变体”是指基本上类似的序列。对于核苷酸序列，保守变体包括这样的序列由于遗传密码的简并性，它们编码本发明的Pi2-样多肽之一的氨基酸序列。例如这些自然存在的等位基因变体能够利用众所周知的分子生物学技术鉴定，例如利用下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术鉴定。变异核苷酸序列也包括合成产生的核苷酸序列，例如利用定点诱变产生的，但是仍然编码本发明的一种Pi2-样蛋白质的核苷酸序列。利用本文其它部分所述的序列比对程序，使用缺省参数测定，本发明的一种具体核苷酸序列的变体与这种具体核苷酸序列通常有至少约40％、50％、60％、65％、70％，通常至少约75％、80％、85％，优选地至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，更优选地至少约98％、99％或更高的序列同一性。
“变异”蛋白质是指由天然蛋白质衍生的一种蛋白质，其产生方法包括在天然蛋白质的N端和/或C端删除(所谓的截短)或者添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个位点处删除或者添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸。本发明包括的变异蛋白质具有生物活性，即它们仍然具有天然蛋白质的希望的生物活性，即，如此处所述的Pi2-样活性。例如，这些变体可能来源于遗传多态性或者来源于人工操作。利用本文其它部分所述的序列比对程序，使用缺省参数测定，本发明的天然Pi2-样蛋白质的生物活性变体与这种天然蛋白质的氨基酸序列有至少约40％、50％、60％、65％、70％，通常至少约75％、80％、85％，优选地至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，更优选地至少约98％、99％或者更高的序列同一性。本发明的蛋白质的一种生物活性变体与该蛋白质的不同可能在于低至1-15个氨基酸残基，低至1-10个，如6-10个，低至5个，低至4、3、2个，乃至1个氨基酸残基。
本发明的蛋白质可以用多种方法改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入。这些操作方法在本领域中公知。例如，Pi2-样蛋白质的氨基酸序列变体能够通过DNA突变制备。诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中公知。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编著(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)和此处引用的参考文献。关于不影响目标蛋白质生物活性的适当氨基酸置换的指南可见Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，在此引用作为参考。保守置换，如一个氨基酸交换为具有相似性质的另一个氨基酸，可能是优选的。
因此，本发明的基因和核苷酸序列包括自然存在的序列，以及突变形式。同样，本发明的蛋白质包括自然存在的蛋白质，及其变异和修饰形式。这些变体仍然具有希望的Pi2-样活性。显然，将在编码变体的DNA中进行的突变不能将该序列置于阅读框之外，优选地不产生能够形成二级mRNA结构的互补区。参见，EP专利申请
发明者王国梁, 瞿绍洪, 周波 申请人:俄亥俄州立大学