专利名称：微生物抗生素抗性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种使用微阵列快速检测微生物对抗生素的抗性和同时确定抗性基因基因型的方法，和/或用于该方法的试剂盒。
背景技术：
过去，尤其在临床环境中抗生素的持续使用增加了对细菌的选择压力，最终导致产生许多对所用试剂表现出抗性的微生物。针对依赖于β-内酰胺环系统的一种主要类型抗生素，细菌产生了称作β-内酰胺酶的酶。该酶能够降解这类试剂，已经普遍存在于不同的微生物种。
迄今为止，已经报道了340种不同的β-内酰胺酶序列。TEMβ-内酰胺酶是一种丝氨酸β-内酰胺酶(即OXA、SHV)，在肠杆菌科的许多不同菌种、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌和淋球菌中都有发现。第一种TEM酶(TEM-1)是于1965年从大肠杆菌(E.coli)中分离得到的，赋予对窄谱头孢菌素、头孢孟多与头孢哌酮钠以及除替莫西林之外的所有抗革兰氏阴性菌的青霉素的抗性。
为了对付这种抗性菌株，已经开发了具有广谱抗药性的抗生素，但是随着它们的广泛应用，又导致了新的抗性的出现。在此期间，TEM-、SHV-和OXA-家族的一些成员表现出所谓的“广谱抗药性内酰胺酶”(ESBL)表型，赋予对各种不同头孢菌素和单内酰胺(monolactam)的抗性。另外，经典TEM-或SHV-酶的衍生物似乎表现出所谓的“抑制剂抗性TEM”-(IRT)表型，赋予对β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸的抗性。已经发现，和亲本TEM-1序列相比ESBL-或IRT-酶主要在其氨基酸序列的1至7个位点上不同，所述的亲本TEM-1序列具有TEMβ-内酰胺酶中至今已经发表的37个不同氨基酸的替换位点。还注意到导致ESBL表型的突变和导致IRT表型的突变不同，虽然有些突变在两种表型中都存在。
一般而言这些抗性菌株，和最初没有注意到的其他抗性菌株的形成会危害对患者的治疗和保护，尤其在临床环境中更是如此，这是因为由于主治医生不能预测施用的抗生素是否能在治疗过程中有效。由于这种原因，对抗性菌株存在的认识对于决定使用哪种抗生素来说是极为重要的。
鉴定病原体和潜在抗性的临床标准步骤是繁重的，需要3天才能明确确定抗性。这些过程大多依赖于使用琼脂扩散试验进行的表型鉴定，该实验虽然有成本效益，但是慢(48小时)。另外，必须对多种抗生素进行测试以鉴定ESBL表型。
根据获得的实验结果选择使用哪种合适的抗生素，但是取样和获得实验结果之间长时间的延迟使患者处于危险中，在严重情况下甚至使之有生命危险。由于这种原因，在正常临床环境下，患者接受广谱抗生素的“先期”施用，期望发挥至少一些效果。但是行动甚至会相应地导致更多抗性菌株的形成。
因此，该领域中显然需要一种方法能够快速且高度可靠地测定生物样品所含微生物中存在的潜在抗性，还需要多种样品的简单处理方法。另外，由于医药领域中的高成本压力，实施该方法不能耗费太大。
发明内容
通过提供一种检测生物样品中对β-内酰胺抗生素表现为抗性的微生物存在与否、并同时确定β-内酰胺抗性基因型的方法，解决了这一问题。所述的方法包括如下步骤(i)获得生物样品；(ii)可选性地分离样品中包含的DNA；(iii)在使互补链相杂交的条件下使样品的DNA和预定位置上包含有不同组捕获探针的微阵列接触，其中一组捕获探针的每个代表都包含序列R1-(X)-R2，其序列是β-内酰胺酶基因序列的选定部分，其中X表示核苷酸三联体和其排列，其中R1和R2每个具有约3至20个核苷酸的长度。其中不同组的捕获探针的选择能够使相邻组开始于第一组捕获探针下游的3n个核苷酸的给定位点，其中n是1至10的一个整数，因此能够涵盖β-内酰胺酶基因核苷酸序列的所需范围。所述的方法还包括步骤(iv)确定是杂交否发生以及在微阵列的哪个位置上发生，其中杂交的发生和位置指示β-内酰胺抗性微生物的存在，还指示其特异抗性。
图1a所示为TEM微阵列的SNP捕获探针布局图。所有的SNP捕获探针都点三次重复。SNP位点按照在所编码氨基酸序列中的位置进行命名，所指为上述的每个三次重复。SNP捕获探针04组加以突出，在右侧放大显示。探针序列中不同的、基本上位于中央的碱基标在左侧。蓝点表示和blaTEM-1β-内酰胺酶基因完美匹配的位置。微阵列上包括有对照用Cy5(青色素5)于5’端标记的探针作为点对照、阳性杂交对照和阴性杂交对照。所有的三个对照序列都和细菌物种不相关。过程对照由blaTEM基因家族中的保守序列组成。
图1b是在杂交站(hybridization station)中与400ng blaTEM-1靶DNA(核苷酸/合成荧光染料的数＝NT/F＝83)进行3小时杂交实验的荧光图像。在一组捕获探针内所有与blaTEM-1完美匹配的位置以最高信号强度所识别。SNP捕获探针组S04加以突出，并放大显示。信号的强度以伪色(false color)显示，蓝色对应于最低信号强度，红色至白色描述最高信号强度。
图2所示为在杂交站中与blaTEM-1(n＝5)(每次杂交使用400ng靶DNA，标记效率变化NT/F＝71-180)进行3小时杂交的结果。此处所示出的是相对强度，其对应于错配或完美匹配信号强度/完美匹配信号强度的比例[(MM或PM)/PM]，因此完美匹配的相对强度为1。错配相对(rel.)强度＜1。可以正确识别所有与blaTEM-1的完美匹配位点(n＝杂交实验数)。
图2a、3b、2c和2d分别示出SNP位点S04-S90、S102-S162.2、S163-S235.2和S236-S276的相对信号强度。
图3所示为(a)blaTEM-1(n＝5)、(b)blaTEM-3(n＝2)、(c)blaTEM-7(n＝2)和(d)blaTEM-8(n＝3)的SNP位点37、102、162、236的完美匹配位点的鉴定。相对强度为信号强度/完美匹配信号强度的比例[(MM或PM)/PM]。和blaTEM-1相比突变氨基酸位点是blaTEM-3、-7、-8中的S37(CAG至AAG，Q至K)；blaTEM-3、-8中的S102(CAG至AAG，E至K)；blaTEM-7、-8中的S162(CGT至AGT，R至S)；blaTEM-3、-8中S236(GGT至AGT，G至S)。其它完美匹配位点与blaTEM-1完美匹配位点相同(数据未示出)。(n＝杂交实验数)。
图4所示为阵列上检测限的确定。此处所示是在Corning杂交室(hybridizationchamber)中使用防护玻璃罩(cover glass)的25-200ng blaTEM-116 DNA的杂交结果(n＝3)。杂交样品DNA的标记效率(NT/F)是87。所显示的信号强度是SNP位点S235的信号强度，是杂交后来自所有探测到的SNP位点的最弱完美匹配信号强度。blaTEM-116于S235处的完美匹配位点是C，错配位点是A、G和T。对于25ng DNA仍可以区分错配位点和完美匹配位点，但信号强度非常弱(＜200)。(n＝杂交实验数)。
图5所示为65ng DNA(NT/F＝57)在不同保温培养时间30min和3小时的杂交结果。此处所示为比强度，其对应于完美匹配强度和平均错配强度之差[PM-(MM1+MM2+MM3)/3]。
图5a、5b分别所示为SNP位点S04-S162.2和S163-S276的比强度。30min时的比强度弱10×，但是仍能够鉴定到所有的完美匹配位点。
具体实施例方式
在本说明书中使用下列定义术语“微列阵”和“寡核苷酸”在本发明中可以互换使用，指连接(优选通过一个单末端共价键)到一个或多个固态支持物的多个不同核苷酸序列，当存在多种支持物时，每种支持物具有多个核苷酸序列。两个术语都可以指支持物上“寡核苷酸”的全部集合或者指其子集。支持物通常由固态表面组成，其可选自以片、盘、凝胶层和/或珠的形式制备的玻璃、电子设备、硅支持物、硅石、金属或者其混合物。
如本发明中所用，术语“探针”定义为能够通过一种或多种类型化学键与互补序列的靶核酸结合的“寡核苷酸”，所述的结合通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成。如此处所使用的，寡核苷酸探针可以包括天然碱基(也就是A、G、C或者T)或修饰碱基(7-脱氮鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷等)。另外，寡核苷酸探针中的碱基可以通过磷酸二酯键之外的键来连接，例如肽键，只要它不干扰杂交即可。
术语“靶核酸”指寡核苷酸探针与之特异杂交的核酸。
术语“捕获探针”在本发明中应该指的是β-内酰胺酶基因的不同长度部分，例如约10和43个核苷酸之间、在支持物的表面上原位化学合成的或者铺在其上的部分。
术语“完美匹配探针”指具有与具体靶序列完美互补的序列的探针。
在本申请中使用的术语“β-内酰胺酶”包括所有目前公知的β-内酰胺酶种类，例如丝氨酸-或锌-β-内酰胺酶，举例来说具体包括TEMβ-内酰胺酶，其形成质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶(例如OXA、SHV)的子集。
此处所用的术语“核苷酸序列”指与所述核酸的碱基相比较出现在核酸中的核苷酸，包括含有如上所述的常见碱基或修饰碱基的核苷酸。提及核苷酸，寡核苷酸、多聚核苷酸等等时，它们包括其中糖-磷酸骨架加以修饰和/或替代的类似物种，只要其杂交性质未被破坏即可。
短语“特定性杂交”指在严格的条件下，当特定核苷酸序列存在于DNA或者其片段的复合混合物中时，一个分子基本与或仅与该特定序列结合、形成双链体或杂交。
本发明中所用的术语“在微阵列上基本同时探测”指可以在微阵列上筛选一个或多个靶序列，基本上同时确定的靶序列的存在与否取决于特定应用的制剂和读取方法等。
在导致本发明的广泛研究期间，本发明人设计了一种新的方式来确定具有对特定的β-内酰胺抗生素表现出抗性之β-内酰胺酶的微生物的存在与否。
为了该目的，本发明方法中使用的微阵列在其预定位置上含有多组通式为R1-(X)-R2的核苷酸序列。A组核苷酸序列含有三个主要组分，即R1、X和R2。R1和R2是具有长度约3至约25个核苷酸的核苷酸序列，来源于微生物β-内酰胺酶基因的感兴趣特定序列。这些序列R1和R2由原β-内酰胺酶基因中称作“X”的三联体分隔开。为了筛选在特定位置上的改变(即“X”)，改变三联体，涵盖氨基酸的所有64种排列。但是，为了实际目的，选择“X”的改变使之能够导致基因序列中一个氨基酸的潜在变化。例如，在原三联体是编码氨基酸丙氨酸的GCT情况下，三联体GCC、GCG和GCA原则上可以不考虑，因为这种突变不导致所得多肽一级结构的改变，所述的所得多肽一级结构的改变最终导致对特定药物抗性的形成。因此，一组核苷酸涵盖β-内酰胺酶基因中感兴趣的特定位点。
在微阵列上，将多个不同的这些组排列以涵盖β-内酰胺酶基因中多个不同的感兴趣的特定位点。原则上，且根据广泛的观点，微阵列提供许多组核苷酸，其中靠近给定组的核苷酸序列R1-(X)-R2(其中例如R1是编码起始甲硫氨酸的ATG，X是β-内酰胺酶基因中的第二个三联体，R2是所述2nd三联体下游的核苷酸序列)，下一个核苷酸序列往下游移动三个核苷酸(例如R1是ATG加上接下来的三个原始核苷酸，X是和起始密码子ATG间隔三个核苷酸的三联体，R2是往下游移动三个核苷酸的核苷酸序列)。为了这一目的，这种微阵列使得“基因步移”(gene-walking)，从而能够测定β-内酰胺酶基因中的任意突变。
这种微阵列使得能够确定包含β-内酰胺酶基因的微生物是否存在于生物样品中。另外，由于β-内酰胺酶基因中的突变位点已经同时得以确定，在突变已知且与特定抗性相联系的情况下，还有可能确定微生物对哪种抗生素具有抗性。从而使主治医生能够马上采取必要的步骤，使用已知有效的一种试剂。
本发明还提供了有关发生在β-内酰胺酶基因中的、尚且未知的突变的信息。在这种情况下，主治医生据初步印象不知道突变是否已经导致对特定试剂的新的抗性的形成。但是，根据该方法中提供的信息，他现在就可以进行测试微生物灵敏性的常规实验。因此，本发明提供了基本预防已形成新抗性的微生物传播的可能，因为抗性可以在早期得以检测/确定，并相应地进行治疗。
当实施本发明的方法时，可能包含一种或多种(不同)表现出抗性的微生物的生物材料用作起始材料。适当样品的例子是血样、组织样品、诸如唾液的身体分泌物等，或包含微生物的培养基样品。对于特定应用，可以适当地将生物样品转移至适于微生物生长的培养基，如板(例如Müller-Hinton琼脂板)上。
可以直接使用生物样品，或者根据本领域现有的方法如根据QIAprepSpinMiniprep试剂盒方案(Qiagen，Hilden，德国)的提取方法从其中分离DNA。可以在本领域中技术人员知识的基础上根据特定起始材料选择获得DNA的可替代的适当方法。在没有使用其他选择步骤的情况下，这种分离步骤有助于防止杂交步骤中大量背景信号的产生。
根据一个实施方案，可以使用一个或多个引物通过PCR对生物样品中包含的或分离的DNA进行扩增，这样提供一个优点，即只放大待研究的特定物质，还引入了选择步骤。在仅使用一个引物的情况下将合成感兴趣DNA的互补链。作为可替代方案，使用至少两个引物，使待研究的物质得以指数扩增。根据一个可替代的实施方案进行巢式PCR，其中使用2对引物。第一套引物的设计用来扩增靶序列周围的序列。然后第二对引物用来扩增扩增序列内部的序列。完成PCR反应之后，如果需要可以对PCR产物加以纯化。
当使用扩增步骤时，可以同时对DNA加以标记，例如通过在扩增过程中掺入带有适当标记的核苷酸。作为可替代方案，将标记物加到核酸上，包括例如添加核酸接头使样品核酸和标记物连接的缺口翻译或末端标记。
适合用于本发明的可检测标记物包括可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任意组分。本发明中的有用标记物包括使用标记的链霉抗生物素蛋白偶联物染色的生物素、磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如诸如Cy5的青色素染料、荧光素、德克萨斯红、若丹明、绿色荧光蛋白等等)、放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和诸如胶体金或有色玻璃或塑料的比色标记物(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。使用这些标记物的专利教导包括美国专利Nos.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。
为了能够检测到单一突变的存在，靶DNA或探针DNA不应太长，否则会发生引起错配的与捕获探针在溶液中的复性或与捕获探针的碱基配对。这种探针DNA的所需长度应为约10至50个核苷酸，优选15至40个，较优选15～30个，更优选15～25个，通过在扩增步骤过程中相应地选择引物而获得，或者在扩增步骤之后将要使用的DNA断裂成片段而获得。
在一定的条件下使所得的靶/探针DNA在微阵列上与捕获探针接触，使得仅发生互补链的杂交。
和微阵列相连的捕获探针可以来源于目前已知的任意β-内酰胺酶基因，例如来源于肠杆菌科如E.coli、肠杆菌属、摩根氏杆菌、变形杆菌属、普罗威登菌属、沙门氏菌属、克雷伯杆菌属、枸橼酸杆菌属、痢疾志贺菌、粘质沙雷氏菌；和非发酵菌，即假单胞菌属、洋葱假单胞菌；和其他与致病相关的革兰氏阴性菌，如嗜血杆菌属、奈瑟菌属的β-内酰胺酶基因(Bradford，Clinical Microbiology Reviews；Oct.2001，p933-951；Thomson，Emerging Infectious Diseases，March-April 2001，p333-336)。发表的不同基因的序列的参考文献处于公众领域，可以从http//www.lahey.org/获得，其文献在此引入以作参考。
作为可替代方案，为了提供针对已知抗性的特定观点，选择捕获探针以使三联体的排列涵盖β-内酰胺酶基因中的已知突变位点，例如TEMβ-内酰胺酶、SHVβ-内酰胺酶、OXAβ-内酰胺酶、K1β-内酰胺酶中与广谱抗药性(ESBL)表型或抑制剂抗性TEM(IRT)表型相关的具体突变。
根据另一个优选的实施方案，选择阵列上的捕获探针以使它们能够涵盖β-内酰胺酶基因中的已知SNP(单核苷酸多态性)位点。表1列举了一些多态性位点和相应的TEM突变。
表1NT位点 NT NT突变AA AA AA突变 突变TEM-XTEM-1 blaTEM-X 位点 TEM-1 TEM-X3-6 AGTGAT 2S D 97，98，99，1087-9 ATTCCT 3I P 97，98，99，10810 CAAAAA 4Q K 87，9255 CTTTTT 19 L F4，9，25，48，49，53，63，73，74，85，86，94，110109 CAGAAG 37 Q K 2，3，7，8，11，16，18，21，22，24，42，44，46，56，59-61，65，66，72，89，101119GCAGTA40AV42146CTCCCC49LP60199 ATGGTG 67 M I 32，37，40，83CTG201 ATGATT 67 M L，V33-36，38，39，45，50，77，78，80，81，82，97233 GTAGAA 78 V E 108244 ATTGTT 82 V I 116269GGTGAT90GD57，66304GAGAAG10EK3，4，6，8，9，13，15，16，17，18，21，22，24，26，43，46，50，522，56 60，62，66，87，88，89，92，94，106，107，111338 GATGGT 11 D G 903365 AGTAAT 12 S N 1052373 ATAGTA 12 I V 80，815382 AGTGGT 12 S G 59，76，897427 CCGGCG 14 P A 953452CACCGC15HR21，561482 GATGGT 16 D G 961484CGTAGT16RS5，7，8，9，10，12，24，26，46，53，60，63，85，86，87，91，TGT2C485CGTCAT16RH6，11，16，27，28，29，43，61，107，1182487 TGGCGG 16 W R 39，783489 TGGTGC 16 W C 833539 ATGACG 18 M T20，32，43，52，63，72，87，88，91，92，93，94106，1070545 GTAGCA 18 A V 1162580 GGCAGC 19 G D 88
4581 GGCGAC 19 G S1084605 CGGCAG 20 R Q702647GGAGAA21GE556703 GCCACC 23 A G225704GCCGGC23AT5，24，865706GGTAGT23GS3，4，8，15，19，20，21，22，25，42，47，48，49，50，52，66，668，71，72，88，89，92，93，94，101，107707 GGTGAT 23 G D1116709 GAGAAG 23 E K5，10，24，27，28，42，46，47，48，49，61，68，71，72，85，867 ，91，93，101721 CGCAGC 24 R S30，31，44，58，65，73，74，77，79，99，TGC 1 CGGC G722 CGCCTC 24 R H51，54CAC 1 L772 GTTATT 25 V I588782 ACGATG 26 T M4，9，13，25，27，42，47，48，49，68，73，74，85，86，94，1101 ，111，118790 AGTGGT 26 S G494812 CGACTA 27 R L38，45，68，82，83CAA 1 Q814 AATGAT 27 N D35，36，37，39，50，78，80，84，2827 GCTGTT 27 A V101，1046854 CATCTT 28 H L97，98，995表中使用了下列缩略词NT位点blaTEM基因的核苷酸序列中的多态性位点；AA位点TEM氨基酸序列中的多态性位点；NT TEM-1TEM1序列中相关位点处的三联体；NT突变TEM-X突变TEM序列中相关位点处的三联体；AA TEM-1TEM-1序列中相关位点处的氨基酸；AA突变TEM-X突变TEM序列中相关位点处的氨基酸；突变TEM-X在相关位点处包含氨基酸替换的TEM突变体(用数字命名2、3指TEM-2、-3...)。
用下划线标出的氨基酸替换仅发生ESBL衍生物中，粗体表示的氨基酸突变仅存在于IRT型酶中。ESBL型TEM酶数字用下划线标出，IRT型酶数字以粗体印刷。
从上表1可以推导出，某些突变存在于两种表型中。和现有技术中β-内酰胺酶的表型鉴定方法相比，根据本发明的、基于确定基因型的方法可以在整个临床环境下监测不同抗性基因的传播，从而为预防这种传播的策略的建立提供有价值的信息。
杂交过程和条件是本领域所熟知的，例如在《分子生物学最新方案》(Currentprotocols in Molecular Biology)(2000)；22章，John Wiley & Sons公司中作有介绍。
例如，杂交步骤可以在杂交室的防护玻璃罩下进行，或者在杂交炉中进行，基本上表现为一种扩散限制过程。作为可替代方案，可以通过摇动进行反应，缩短所需的杂交时间。当使用涉及微阵列移动的杂交时，杂交时间可以缩短至60分钟或更短，优选30分钟或更短。其结果是，总的分析可以在少于4小时，较优选3.5小时之内进行。这是尤其有意义的，因为它使得能够在患者达到医院或联系医生的同一天获得结果。
然后将确定一种或多种特异性杂交的存在与否，其将最终指示一种或多种β-内酰胺酶编码序列的存在与否，进而指示β-内酰胺抗性微生物的存在与否。
可以在杂交步骤之前检测与靶DNA结合的标记物，或者在阵列上进行标记反应来实现这一点。所谓的“直接标记物”是杂交之前直接结合于或掺入靶(样品)核酸的可检测标记物。相反，所谓的“间接标记物”在杂交之后连接到杂交双链体。间接标记物还可以和杂交之前已经结合了靶核酸的结合部分(moity)相结合。对标记核酸和检测标记的杂交核酸的方法的详细评论参见《生物化学和分子生物学实验室技术》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)，24卷使用核酸探针杂交，P.Tijssen编写，Elsevier，N.Y.(1993)。
另外，存在于阵列上的捕获探针还可在其3’端带有标记。结合靶DNA之后，DNA/DNA杂合体用特定的酶切割，从而将标记物从结合有靶DNA的捕获探针释放。因此，在该实施方案中，信号的减弱表示样品中存在β-内酰胺酶基因。
原则上，检测与探针杂交的标记靶核酸的手段是本领域的技术人员所公知的。例如，当使用比色标记物时，标记的简单可视性是足够的。当使用放射性标记的探针时，例如使用照相软片或固态检测器检测射线是足够的。而在一个优选的实施方案中，靶核酸使用荧光标记物标记，探针阵列上标记物的定位可以使用例如荧光显微镜完成。在特定荧光标记物的激发波长处用光源激发杂交的阵列，所得的荧光在发射波长处加以检测。在一个具体的优选实施方案中，激发光源是适于激发荧光标记物的激光。
成像系统(共聚焦显微镜)可以用计算机-控制站自动化，以自动扫描整个高密度阵列。同样，显微镜可以配有与自动化数据获得系统相连的光换能器(phototransducer)(例如光电倍增器、固态阵列、CCD相机等)，以便自动记录阵列上与每个寡核苷酸杂交所产生的荧光信号。
在一个最优选的实施方案中，本方法使用寡核苷酸微阵列来鉴定119种至今所述TEMβ-内酰胺酶的单核苷酸多态性(SNP)(http//www.lahey.org/Studies)。这种微阵列含有41个SNP(单核苷酸多态性)位点(ESBL、IRT或二者兼而有之)寡核苷酸探针，具有各种长度(17-27个碱基)(表2)。
表2
TEM阵列的探针序列表。探针序列从5’至3’给出。
具有氨基酸替换的三联体用下划线标出。
每个SNP位点(根据blaTEM氨基酸序列中的位置命名)都存在4个探针，中央碱基位置处为A、G、C或T，在探针序列中标为N。
每个探针还给出了探针长度(17～27个碱基之间)和解链温度(中央碱基＝G的探针；50mMDNA浓度、50mM盐浓度，如Breslauer er al.，Proc.Nat.Acad.Sci.83，3746-50，1986所述计算)。(*探针＝具有一个15胸苷间隔区)
除了TEMβ-内酰胺酶末端常设的第2、3和285位氨基酸之外，这些探针涵盖了至今发表的大多数氨基酸替换位点(www.lahey.org/studies/web.htm)。探针的设计使SNP位于探针序列的中央碱基处，以最大限度地区分杂交过程中的完美匹配/错配。对于每个SNP，设计4个探针的探针组，其中除了中央碱基为A、T、G或C之外，其他序列相同。SNP探针根据TEM序列中氨基酸替换的位置进行命名，也就是说S161指在TEM氨基酸序列第161位的多态性。对于某些氨基酸替换位置来说，一个三联体中存在有两种多态性，这样设计两组(2×4个探针)SNP探针(例如S162、162.2)。在阵列上还包括几组对照点对照，是5’端带有Cy5标记物的探针；和标记的寡核苷酸靶点互补的阳性杂交对照，在杂交过程中掺入；以及阴性杂交对照。所有这些对照都由与微生物物种不相关的序列组成。过程对照对应于blaTEM基因家族中的保守序列。每个SNP探针点三个重复。对照可以点多次，分布在阵列表面之上。阵列布局如图1a所示，杂交blaTEM-1靶DNA的TEM阵列的荧光图像如图1b所示。
对于使用本发明方法中的微阵列来说，使用blaTEM旁侧的引物在PCR过程中对从临床样品分离的质粒DNA加以扩增和标记，产生一个861bp的片段。
测定标记物的掺入比例(掺入核苷酸的数目)。用DNaseI将靶DNA断裂成片段大小约15至150bp，以便提高杂交效率。然后将阵列用靶DNA杂交，使用适当的设备如扫描仪获得杂交信号(图1b)。
进行2小时扩增、30min纯化和标记、3小时杂交、30min洗涤，总的分析时间为6小时。由于将该阵列应用于临床环境时分析应该尽可能快，本发明方法可以使杂交时间低至30min。相关数据如图5所示。即使30分钟孵育时间时的比强度比预期要弱，所有的完美配对仍然能够明确地得以鉴定。
可以在防护玻璃罩下进行杂交步骤，因此这种情况下的杂交是扩散限制过程。另外，杂交还可以在对杂交溶液加以摇动下进行，产生更高的强度，从而使杂交可以缩短至小于30分钟时仍能提供可接受的强度。为了这一目的，总的分析时间可以缩短至小于3.5小时。
本方法能够可重复地、灵敏地鉴定ESBL型β-内酰胺酶的各种基因。由于分析时间少于3至4小时，该方法是ESBL和/或IRT TEMβ-内酰胺酶的非常快速的检测方法，是监测例如临床环境中抗性基因传播的有价值的工具。
为了提供所需的可靠性，微阵列包含至少一种点对照、阳性杂交对照、阴性杂交对照和/或过程对照。
本发明的另一个优点是它甚至能够检测一个三联体中存在的两种多态性，在这种情况下设计两套SNP探针，并使之存在于微阵列上。
本发明还提供了检测编码β-内酰胺酶的多个核苷酸序列存在与否和/或确定一种或多种微生物的核苷酸序列中多个β-内酰胺酶抗性/突变存在与否的试剂盒，所述的试剂盒包括如上所述的微阵列、可选的缓冲液以及适于实施本发明方法的试剂。
根据本发明的方法和试剂盒都可用于设计药用组合物，用于治疗需要用抗生素治疗的患者。尤其是可以设计一种药用组合物，所述的药用组合物包括特定抗生素，具体是一种或多种β-内酰胺，且如果需要包括一种或多种其他β-内酰胺酶抑制剂，或选择具有不同作用模式的一种抗生素。
本发明还允许向患者提供具有最小延迟时间的简明抗生素治疗。例如在少于1个工作日之内，例如尤其在约3.5小时之内。结果是可以向患者提供更为有效的治疗(在供应更有效药用组合物的基础上)。其结果是，期望疾病的持续时间和严重程度也大大降低。
本发明的方法和试剂盒可以用于自动化或部分自动化的设备中，从而使工作成本保持在基本低水平。因而本发明还提供了可以大规模(如果需要)并以基本低的成本进行快速微生物抗生素抗性检测的方法和试剂盒。
本发明的其他特征和优点将在下面的发明详述和附图中描述，从下面的发明详述和附图中本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
现在将通过示例性而非限制性的方式给出本发明的实施例。
实施例1设计微阵列1.寡核苷酸阵列构成寡核苷酸阵列由具有17～27个碱基的不同长度的168个寡核苷酸捕获探针构成。捕获探针和对照探针序列在表2(上文)中给出，具有一个15胸苷间隔区的探针标有星号。阵列布局如图1所示。
形成寡核苷酸微阵列来确定TEMβ-内酰胺酶基因型。对于41个SNP(单核苷酸多态性)位点(ESBL、IRT或二者兼而有之)来说，设计具有各种长度(17～27个碱基)的寡核苷酸探针(表2)。除了TEMβ-内酰胺酶末端常设的第2、3和285位氨基酸之外，这些探针涵盖了本领域中目前已知的大多数氨基酸替换位点。
设计探针使SNP处于探针序列中基本上位于中央的碱基，以最大限度区分杂交过程中的完美匹配/错配。对于每个SNP，设计4个探针的探针组，其中除了基本上位于中央的碱基为A、T、G或C之外，其他序列相同。SNP探针根据TEM序列中氨基酸替换的位置进行命名，也就是说S161指在TEM氨基酸序列第161位的多态性。对于某些氨基酸替换位置来说，一个三联体中存在有两种多态性，这样设计两组(2×4个探针)SNP探针(例如S162、162.2)。在阵列上还包括几组对照点对照，是5’端带有Cy5标记物的探针；和标记的寡核苷酸靶点互补的阳性杂交对照，在杂交过程中掺入；以及阴性杂交对照。所有这些对照都由和微生物物种不相关的序列组成。过程对照对应于blaTEM基因家族中的保守序列。每个SNP探针点三个重复。对照可以点多次，分布在阵列表面之上。阵列布局如图1a所示，杂交blaTEM-1靶DNA的TEM阵列的荧光图像如图1b所示。
探针以20μM的浓度溶解于S1点样(spotting)缓冲液(Eppendorf AG，Hamburg，德国)中，用Microgrid II(BioRobotics，UK)点在CreativChipOligo-Slide(EppendorfAG，Hamburg，Germany)上。点尺寸约150μm，点与点的距离为230μm。对于永久固定来说，寡核苷酸阵列于120℃孵育。根据CreativChip方案进行封闭。
2.DNA分离菌株在Müller-Hinton琼脂板上于37℃孵育过夜。一环(loop)菌细胞溶解于250μl缓冲液P1中，并根据QIAprepSpin Miniprep试剂盒方案(Qiagen，Hilden，德国)提取质粒DNA。
3.BlaTEM的扩增、标记和纯化通过PCR合成靶DNA。用于BlaTEM基因的扩增引物为temforw(5’-atgagtattcaacatttccg-3’)和temrev(5’-ttaatcagtgaggcacctat-3’)。对于PCR扩增和标记来说，1～75ng质粒DNA补充含有50μM dATP、dGTP、dTTP、30μM dCTP、20μM Cy5-dCTP(Amersham Biosciences，Little Chalfont，英国)和10U Taq DNA聚合酶(Eppendorf AG，Hamburg，德国)的100μl PCR缓冲液(2.5mM Mg(OAc)2、50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3)。扩增在Mastercycler Gradient(Eppendorf AG，Hamburg，德国)中进行。起始变性步骤(94℃ 1min)之后进行30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)，最后于72℃延伸4min。
使用QIAprepSpin PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)根据厂商的方案纯化PCR产物。DNA洗脱在30μl双蒸H2O中。
4.断裂成片段室温下，30ng/μl浓度的扩增和标记的靶DNA用0.0115U/μl DNaseI(Promega，Madison，美国)于反应缓冲液(40mM Tris-HCl pH8，10mM MgSO4，1mM CaCl2)中断裂5min。加入3mM EGTA并于65℃孵育10min终止反应。
结果，靶DNA经DNaseI断裂成片段大小约15至150bp，杂交效率由此得以提高。
5.杂交可以实行两种杂交方法杂交变式I各种量的断裂的靶DNA(25～400ng)加上对照DNA(0.05pmol)在18×18mm防护玻璃罩下于30μl的6×SSPE中杂交，在杂交室(Corning，NY，美国)和杂交炉(OV5，Biometra，Gttingen，德国)中于45℃孵育3小时。
杂交后，在室温下将玻片用2×SSC、0.1％SDS，然后用2×SSC，最后用0.2×SSC边摇动边洗涤，每次10分钟，并用N2干燥。
杂交变式II还可以使用杂交站HS 4800(Tecan，Crailsheim，德国)进行杂交，首先用6×SSPE于45℃进行洗涤，然后是探针注射(400ng靶DNA，0.05pmol对照DNA于65μl的6×SSPE中)和45℃中等摇动强度下杂交3小时。在室温下将玻片于2×SSC0.1％SDS中2次洗涤2min，在0.2×SSC中洗涤1.5min。玻片用N2干燥2min。
图1b所示为与靶DNA杂交之后的阵列实例，杂交信号使用荧光扫描仪获得。在杂交站中，使阵列与5种不同blaTEM-1样品杂交3小时，所述的blaTEM-1样品和等量靶DNA(400ng)具有各种掺入比例(NT/F＝76-180)。
6.阵列分析使用GMS 418 Array Scanner(Affymetrix，Santa Clara，美国)获得杂交信号，通过ImageneTM，Version3.0(Biodiscovery Inc.，Los Angeles，美国)对信号强度进行定量。
获得信号强度，减去局部背景得到净信号强度。这些用于计算一个阵列上三个重复的平均净强度。不同阵列上同一探针和不同靶DNA样品杂交的平均净强度变异系数大于三，这是由于掺入比例或断裂效率的差异。因为应该确定错配和完美匹配信号强度的比例是否仍然可以重复，因此计算相对强度。这对应于一个SNP探针组中错配或完美匹配信号强度/完美匹配强度[(MM或PM)/PM)。因此，所有的完美匹配相对强度对应于1，错配相对强度应＜1。相对强度(n＝5)的平均数和标准偏差在图2中给出。BlaTEM-1的所有完美匹配位点能够在每个样品中得以鉴定。平均错配强度不同，其中大多数维持在0.4以下，只有S143、S161、S182、S276表现出达0.6的较高值。标准偏差在0.01至0.21之间变动。对于大多数位点来说，[(MM或PM)/PM]比例是可重复的＜+/-10％。只有位点127、235、236.2、276的偏差略高，但是完美匹配的鉴定并非不明确。荧光团的掺入比例(核苷酸/掺入的荧光染料的数)通过测定OD加以确定。
使用不同的BlaTEM-1基因变体如BlaTEM-1、-3、-7、-8、-116作为靶DNA进一步证实阵列的有效性。BlaTEM-1、-3、-7、-8的鉴定结果以相对强度值形式在图3中给出。只显示了和BlaTEM-1相比有差异的SNP位点。和BlaTEM-1相比的突变氨基酸位点是BlaTEM-3、-7、-8中的S37(CAG至AAG，Q至K)；BlaTEM-3、-8中的S102(GAG至AAG，E至K)；BlaTEM-7、-8中的S162(CGT至AGT，R至S)；BlaTEM-3、-8中的S236(GGT至AGT，G至S)。相关SNP位点的分辨力不同，因为完美匹配/错配比例总是＞2.5。
7.检测限下一步是确定阵列上靶DNA的检测限。25至200ng同样扩增和断裂的BlaTEM-116靶DNA(NT/F＝87)于Corning杂交室中杂交3小时。如所期望的，信号强度随着靶DNA量的增加而增加。图4中显示的净信号强度对应于SNP235，是该实验中杂交后检测到的SNP位点中的最弱信号强度。BlaTEM-116于位点S235处的完美匹配位点C，错配位点为A、G和T。对于25ng靶DNA来说，仍可以将完美匹配位点和错配位点区别开。完美匹配/错配比例仍＞2，但是净信号强度相当低(＜200)。因为低信号强度下探针信号和背景信号的区别更难，因此完美匹配鉴定变得更为不可靠。检测限在25～50ng靶DNA(NT/F＝87)之间。
8.使用杂交变式III的分析时间杂交变式III可以将杂交时间从3小时缩短至30min。阵列与65ng的BlaTEM-116靶DNA(NT/F＝57)于Corning杂交室中杂交30分钟和3小时。对应的数据于图5中示出。结果表示为比强度，对应于净完美匹配强度和平均净错配强度之差[PM-(MM1+MM2+MM3)/3]。如所期望的，30分钟孵育时间的比强度弱10×，但是仍能明确地鉴定到所有的完美匹配位点。该测试在防护玻璃罩下进行，因此在这种情况下杂交是扩散限制步骤。在杂交站中杂交过程中对杂交溶液加以摇动进行同样的测试，产生更高的强度，因此杂交可以缩短至小于30分钟。这样将总分析时间缩短至＜3.5小时。
9.结果上面描述的确定TEMβ-内酰胺酶基因型的阵列已经表明能够可重复地、灵敏地鉴定ESBL型β-内酰胺酶的各种基因。由于分析时间少于3.5小时，该方法是ESBL和/或IRT TEMβ-内酰胺酶的非常快速检测方法，将成为监测临床环境中这些抗性基因传播的有价值工具。
权利要求
1.一种检测β-内酰胺抗性微生物在生物样品中存在与否并同时确定β-内酰胺抗性的基因型的方法，所述的方法包括以下步骤(i)获得生物样品；(ii)可选地分离样品中包含的DNA；(iii)在使互补链相杂交的条件下使样品的DNA和预定位置上包含有不同组捕获探针的微阵列接触，(a)其中一组捕获探针的每个代表都包含序列R1-(X)-R2，其序列是β-内酰胺酶基因序列的选定部分，其中X表示一个核苷酸三联体和其排列，其中R1和R2每个具有约3至20个核苷酸的长度，(b)其中不同组的捕获探针的选择能够使相邻组开始于第一组捕获探针下游的3n个核苷酸的给定位点，其中n是1至10的一个整数，因此能够涵盖β-内酰胺酶基因核苷酸序列的所需范围，和(iv)确定杂交是否发生以及在微阵列的哪个位置上发生，其中杂交的发生和位置指示β-内酰胺抗性微生物的存在，还指示其特异抗性。
2.根据权利要求1的方法，其中DNA在与微阵列接触之前先从生物样品中分离。
3.权利要求1或2的方法，其中样品中包含的DNA借助一个或多个引物得以扩增。
4.权利要求3的方法，其中扩增的DNA在接触步骤之前先断裂成片段。
5.根据权利要求1的方法，其中序列R1-(X)-R2来源于选自大肠杆菌、假单胞菌属、嗜血杆菌属和奈瑟菌属、肠杆菌属、肠杆菌科(产气肠杆菌、摩根氏杆菌、奇异变型杆菌、阴沟杆菌、变形杆菌属、普罗威登菌属、沙门氏菌属)，克雷伯杆菌属(克雷白氏肺炎杆菌、臭鼻克雷伯菌、产酸克雷伯菌)，黄褐二氧化碳嗜纤维菌、枸橼酸杆菌属、粘质沙雷氏菌、痢疾杆菌、洋葱假单胞菌的微生物的β-内酰胺酶。
6.根据前面权利要求任一项的方法，其中捕获探针的选择能够使要排列的三联体涵盖β-内酰胺酶基因的已知SNP位点。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述的β-内酰胺酶是丝氨酸-或锌-β-内酰胺酶。
8.根据权利要求5至7中任一项的方法，其中β-内酰胺酶选自TEM β-内酰胺酶、SHVβ-内酰胺酶、OXAβ-内酰胺酶或表现出广谱抗药性(ESBL)表型或抑制剂抗性TEM(IRT)表型的β-内酰胺酶。
9.根据权利要求8的方法，其中来源于β-内酰胺酶基因的序列如表I所示。
10.根据权利要求4至7中任一项的方法，其中靶DNA断裂成具有约15bp至约50bp大小的片段。
11.根据前面任一项权利要求的方法，其中从样品中获得的、或扩增的或断裂的DNA在和捕获探针相接触之前先加以标记。
12.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中标记反应在阵列上进行。
13.根据权利要求9或10任一项的方法，其中标记物选自荧光标记物、比色标记物、放射标记物和电学、电化学和/或酶检测标记物。
14.检测生物样品中β-内酰胺抗性微生物存在与否并同时确定β-内酰胺抗性基因型的试剂盒，包括(i)微阵列，预定位置上包含有不同组捕获探针；(a)其中一组捕获探针的每个代表都包含序列R1-(X)-R2，其序列是β-内酰胺酶基因序列的选定部分，其中X表示核苷酸三联体和其排列，其中R1和R2每个具有约3至20个核苷酸的长度，(b)其中不同组的捕获探针的选择能够使相邻组开始于第一组捕获探针下游3n个核苷酸的给定位点，其中n是1至10的一个整数，因此能够涵盖β-内酰胺酶基因核苷酸序列的所需范围，和(ii)用于实施所述方法的缓冲液和试剂。
全文摘要
本发明涉及使用微阵列快速检测微生物β－内酰胺抗性的方法，和/或快速检测编码微生物β－内酰胺酶的核苷酸序列的方法，及其检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1644710SQ200410080630
公开日2005年7月27日 申请日期2004年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者韦雷娜·容, 桑托西·埃扎奇, 米洛拉德·苏沙, 科尔内留斯·克纳比, 罗尔夫·施密特, 齐尔·T·巴赫曼 申请人:艾本德股份有限公司