专利名称：使用基因表达盒遗传调控植物细胞中的半纤维素、纤维素和糖醛酸的生物合成的方法
技术领域：
本发明涉及编码参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成代谢途径的酶的基因表达盒，并涉及通过将一种或多种基因表达盒导入所述细胞来遗传转化植物细胞的方法。另外，本发明涉及植物或植物部分中的代谢物含量和/或该代谢途径的组分的改变。
本发明涉及分离的基因和各自编码的参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成的酶。
本发明还涉及获取经遗传修饰的植物、其衍生的植物和种子，以及源自该植物的木材、纸和纤维素的方法，和它们的应用。
背景技术：
已知纤维素浆的化学组分，主要涉及半纤维素的存在，会决定纸的物理性质，以及纤维素生产过程中的物理-化学和光学性质(kappa、粘度、产率、白度和白度反转(whiteness reversion))。
纤维素是植物界细胞壁中最丰富的多糖。它是含有无水葡萄糖β(1→4)单元的线性聚合物。它是木材并由此是纸的主要组分。其它植物也在细胞壁中具有大量的纤维，例如棉花。纤维素分子排列成能形成纤丝的平行链束，其通过聚合材料半纤维素和其它物质彼此相连。
细胞壁的另一种重要的组分是半纤维素。半纤维素由几种多糖组成，例如葡聚糖，木聚糖，木糖葡聚糖和甘露聚糖。这样的多糖由含有两种或多种下述的糖的聚合物组成D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-葡糖醛酸和它的衍生物4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖，和D-半乳糖醛酸(Vickery & Vickery，(1981)Secondaryplant metabolism.pp.335，Macmillan Press Ltd.，London)。该组多糖的特征在于由1，4β-木聚糖残基形成的中心结构，和由葡糖醛酸分子、阿拉伯糖和甘露聚糖组成的分支。
已知在木材蒸煮中，纤维素浆中的半纤维素浓度主要受活性碱的影响，所以当使用高浓度的所述试剂时，观察到低的半纤维素保留，以及物理化学性质(kappa、粘度、纤维素产率和白度)的变化。
可以根据酸式半纤维素中的糖醛酸(其存在有大量的该酸)和中性半纤维素(当它具有低浓度的糖醛酸时)的量对半纤维素分类。
另外，糖醛酐浓度会影响所获得的纤维素浆的kappa数和ISO白度，表明复合物的形成赋予浆(而不仅仅赋予剩余的木质素碎片)颜色。
半纤维素保留允许生产具有差异的物理机械性能的浆和具有不同表面组分的纤维，从而影响纸的打印和包装特性。
半纤维素的生物合成，以及其它细胞壁组分的生物合成，依赖于通过叶绿体的光合作用生产的糖(UDP-葡萄糖磷酸化的糖)的供应。光合作用固定的碳以磷酸丙糖(磷酸二羟丙酮或DHAP)的形式从叶绿体输出到细胞质，从一系列的代谢反应开始，其中流向取决于几个因素，例如尤其是叶子发育阶段、植物的生理状态和营养条件。在嫩叶中，大部分代谢流优先用于合成脂类，通过磷酸戊糖(用于合成核酸)，糖酵解(产生ATP和丙酮酸)，三羧酸(TCA)循环，氨基酸合成，和糖氧化途径，负责合成细胞壁组分。
半纤维素生物合成中的另一个重要组分是肌醇氧化途径(LoewusF.A.等人，(1962)″Metabolism of myo-inositol in plantsconversion to pectin，hemicellulose，D-xylose，and sugar acids.Proc Natl Acad Sci USA，48421-425；Loewus FA and DickinsonDB(1982)Cyclitols.InEncyclopedia of plant physiol.，newseries，Vol.13A，Carbohydrates IIntracellular Carbohydrates，F.A.Loewus，W.Tanner eds.，p.193-216；Loewus F.A.等人，(2000)″Myo-inositol metabolism in plants″.Plant Science，1501-19)。肌醇由UDP-葡萄糖的相同前体葡萄糖-6-P形成。该化合物是许多代谢产物的重要前体，诸如肌醇磷酸、磷酸肌醇、甲基化的衍生物和吲哚乙酸(IAA)缀合物，和葡糖醛酸。肌醇生产的第一步包含从D-葡萄糖-6-P合成肌醇-1-磷酸(Ins-1P)，其由肌醇3-磷酸合酶(MIPS，EC 5.5.1.4)催化。所产生的肌醇-1-P然后通过肌醇单磷酸酶(IMP，EC 3.1.3.25)去磷酸化以释放肌醇。这2个代谢步骤决定了用于细胞的正常生长和其它基本功能的基础化合物的形成。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中肌醇水平的减少，不允许正常生长(Henry S.A.等人，(1977)″Growth and metabolism ofinositol-starved Saccharomyces cerevisiae″.J.Bacteriol.，130472-484)。在植物细胞和生长的组织培养物中，减少细胞内的肌醇量，会抑制细胞分裂(Biffen，和Hanke，(1990)″Reduction in the levelof intracellular myo-inositol in culture soybean(Glycine Max)cells inhibits cell division″.Biochem.J.，265809-814；Loewus和Dickinson，above；Loewus和Loewus(1983)″Myo-inositolits biosynthesis and metabolism″.Annu.Rev.Plant Physiol.，34137-161；Biswas等人，(1984)″Myo-inositolpolyphosphates and their role in cellular metabolismaproposed involving glucose-6-phosphate and myo-inositolphosphates ″.InSubcellular Biochemistry(Roodyn，D.B.，ed.).Plenum Press，London，237-280；Loewus(1990)″Inositolbiosynthesis″.InDJ Moore，WF Boss，and F.Loewus(ed.)，″Inositol metabolism in plants″.Wiley-Liss，New York，p.13-19)。使用编码马铃薯基因的cDNA StIPS的反义表达，在具有抑制的MI PS酶活性的遗传修饰的马铃薯植物中，观察到了肌醇生物合成的减少。叶子中该酶活性的减少，在野生植物中观察到的水平的约20％，导致肌醇、半乳糖醇和棉子糖含量的强烈减少(分别大约7％、5％和12％)。遗传修饰的植物呈现出顶端优势的减少，形态的变化，过早的叶老化和块茎重量的减少。这些结果证实了肌醇代谢在植物生理和发育中的重要性。
众所周知，为了改变农艺学性状，通常在性质上是多基因的多个基因会参与性状表达。在代谢途径的情况中，由独立基因编码的酶能一起作用，将底物转化成产物。根据本发明，改变代谢途径的一种途径是通过所述基因表达盒的导入，使其导入到植物细胞中。
在以木材作为用于生产纤维素浆的主要原料的情况下，在阔叶和针叶类植物组的树木的半纤维素中的水平和单体单元方面、并因此在获得的浆的化学组成方面观察到显著差异(Rydholm，(1965)″PulpingProcesses″，Interscience Publishers，New York，3，p.254)。在牛皮纸制浆过程(kraft pulping process)中获得的桉树属植物的原色浆，主要由碳水化合物和小部分(约3％)木质素聚合物碎片的混合物形成。
用针叶树的木材进行的研究表明，在制浆过程中可以促进半纤维素的保留(Genco等人，(1990)″Hemicellulose retention duringkraft pulping″.TAPPI Journal，April223-233)。根据Macintosh，D.C.(1963)TAPPI Journal 46(5)273和Spielberg，H.(1966)″The effect of hemicellulose on the mechanical properties ofindividual pulp fibers″.TAPPI Journal，49(9)388，浆中半纤维素浓度的增加，会影响物理机械性质，其增加弹性、破裂所需的力和自动破裂前的长度。
Foelkel，C.(1997)″Qualidade da madeira de eucalipto paraatendimento das exigências do mercado de celulose e papel″(″Quality of eucalyptus wood to meet the demands of the paperand cellulose market″).InIUFRO Conference on Silvicultureand Improvement of Eucalypts，Salvador，Anais.ColomboEMBRAPA/CNPF，v.3，p.15-22证实，涉及木材质量的过程与生产规模的变化直接相关，使得森林和木材质量育种计划(特别是对于桉树属植物)体现量性方面并促进程序。遗传改良计划是普遍的，主要在森林区，产生能生产12-16吨牛皮纸纤维素/公顷/年的树。通过体积生长、木材密度、木质素含量和去木质素的容易度，和蒸煮后纯化的纤维素的产率，获得了显著的产率。但是，罕见超出农艺学特性的育种计划，诸如开发具有与纸漂白和终产物特征有关的特征的木材(Foelkel，C，同上)。
通过纤维的结晶区域中的水插入，半纤维素浓度也会影响在浆精制中消耗的能量(Giertz，H.W.(1948)″Cellulosa och Papper″，SPC，1908-1948 Review，Stockholm，4171908-1948)。该现象会减少在精制过程中消耗的能量，除了经济效益外，还可以获得具有增强的物理机械性能的产品。
半纤维素浓度也会影响纤维表面的化学组成。Isogai等人(1997)″Effects of carboxyl groups in pulp on retention of alkylketenedimmer″.Journal of Pulp and Paper Science，23(5)215表明，羧酸的存在，可以影响与烷基烯酮类调整剂(alkylketene dimmer)(在纸注胶(paper gluing)中使用的一种化合物)的反应。存在于纤维表面上的官能团也会影响纤维-纤维相互作用(Carlsson，G.(1996)″Surface composition of wood pulp fibres-relevance towettability，sorption and adhesion″.Dissertation Thesis，Royal Institute of Technology，Stockholm，Sweden)，用于涂层的纤维添加剂(Biermann等人，(1997)″A new sizing agentStyrene-maleic anhydride copolymer with alum mordants″.TAPPIJournal，801-277)，和使用的木材的类型会影响胶体和聚合电解质性质(Rydholm，S.A.，同上)，制浆条件(Karlsson和Westermark，(1997)″The significance of glucomannan for the condensationof cellulose and lignin under kraft pulping conditions.″NordicPulp and Paper Research Journal，12(2)90p；Treimanis，A.(1996)“Wood pulp fiber structure and chemical composition，theirinfluence on technological processes”.Nordic Pulp and PaperResearch Journal，3146p)和在漂白阶段使用的不同试剂(Laineand Stenius，(1996)″The effect of ECF and TCF bleaching on thesurface chemical composition of kraft pulp as determined byESCA″.Nordic Pulp and Paper Research Journal，3201 p)。
Milanez等人((1982)″Influência das hemiceluloses naspropriedades óticas e físico-mecnicas da polpa″(The influenceof hemicellulose on the optical and physico-mechanicalproperties of the pulp).Proceedings of ABTCP，XV CongressoAnual，155)研究了半纤维素对桉树浆的物理机械和光学性质的作用，他们使用提取法以5％NaOH作为半纤维素含量(戊聚糖)的近似值。获得的结果表明，在5％NaOH时的提取物浓度的增加，会造成精制所需能量的减少和纤维素浆的物理机械性能的增加。
众所周知，桉树牛皮纸纤维素主要用于生产2类纸打印/书写和卫生。打印和书写纸应当具有性质，例如尤其是亮度、不透明度、成型、比容、孔隙率、适印性、强度(resistance)、尺寸稳定性(Foelkel，C.，同上)。
选择的将外源基因插入植物细胞的方法，对于植物的成功转化是重要的。这些方法的基础包含，将目标基因插入具有标记基因的宿主植物基因组，该标记基因允许从未遗传修饰的细胞中选择对特定抗生素、除草剂或其它选择剂抗性的遗传修饰的细胞。这些方法通常能有效地将基因导入宿主植物。生物技术计划中的植物转化由将片段(基因表达盒)导入靶细胞的基因组组成。能繁殖的植物应当由单个的转化细胞生成，且插入的表达盒应当能通过种子传递到连续世代。
发明内容
本发明使用分子生物学技术，组织培养和基因转移，在有义和反义方向，改变编码参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成的代谢途径的酶的基因的表达。另外，本发明涉及分离负责目标性状的基因，其定位于其它基因组的基因并从中分离，并导入用于靶植物转化的双载体中。因此，以控制的方式，将基因表达盒导入植物细胞，独立于传粉过程，修饰受体生物的基因组。
在本发明的一个实施方案中，涉及编码与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸生物合成有关的酶的基因表达盒，和这些盒的应用。
本发明还涉及改变编码上述生物合成酶的基因的表达，以及改变半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的组成和/或含量。其还涉及调控编码参与上述化合物的生物合成的酶的基因的表达，以及它们在这些植物或这些植物的部分中的浓度和/或这些多肽水平。调控受植物中本发明的在这些多肽的浓度和/或水平上的增加或降低的影响。
本发明还涉及遗传转化植物细胞的方法，其中导入了一种或多种编码与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成有关的酶的基因表达盒。
本发明还涉及遗传修饰的植物和用于获得这些植物的方法。还涉及源自遗传修饰的植物的植物，其具有一种或多种编码与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成有关的酶的基因表达盒。
本发明还涉及来自遗传修饰的植物的遗传修饰的种子，最后，涉及来自所述遗传修饰的植物的木材和纤维素，和它们的应用。
本发明的植物细胞遗传转化的方法使用众所周知的用于导入目标基因表达盒的技术，例如生物轰击、电穿孔、显微注射、宏观注射或根瘤土壤杆菌-介导(Agrobacterium tumefaciens-mediated)的转化，用于所述基因在靶细胞中的抑制以及过表达。优选地，但不限于该实施方案，将盒克隆进双载体，并用于遗传转化根瘤土壤杆菌。该细菌天然地存在于土壤中，且被认为是天然的工程，是转化植物的有效载体。
根据本发明，以控制的方式，将基因表达盒导入植物细胞，独立于传粉过程，修饰受体生物的基因组。负责目标特性的基因，定位于基因组的其它基因并从中分离，并导入用于靶细胞转化的双载体中。该全能现象允许从原始转化的具有嵌合构造的细胞获得遗传修饰的植物。
根据本发明，所述基因表达盒通过有义方向过表达或通过反义方向抑制一种或多种编码所述目标酶的基因。
根据本发明，遗传修饰的植物含有一种或多种编码所述目标酶的基因表达盒，该基因以有义或反义方向表达。
本发明还涉及获得遗传修饰的植物的方法，其包含下述阶段；(a)通过导入编码本发明的目标酶的基因表达盒，例如通过生物轰击、电穿孔、显微注射、宏观注射或根瘤土壤杆菌-介导的转化，遗传转化植物细胞；(b)再生阶段(a)的细胞；(c)以足以基本上改变半纤维素和/或纤维素和/或糖醛酸生物合成的代谢途径的量，表达在阶段(b)的细胞中构建的DNA；和(d)获得修饰的植物。
一种或多种基因表达盒在植物细胞中的导入会造成半纤维素(尤其是木聚糖)、纤维素和/或糖醛酸(尤其是葡糖醛酸)的代谢途径的改变，根据工业目的，改变工艺的产率、化学消耗和生产质量。因而，本发明提高了用于纤维素和纸生产用途的木材质量。
本发明的一个目的是，通过改变半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的代谢途径，改变植物细胞壁纤维(焦点集中在被子植物尤其是桉树属植物和裸子植物)的化学组分，提高木材质量。更具体地，通过个别地或一起以有义和反义方向改变一种或多种负责参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸生物合成的酶的基因，实现代谢途径变化。这也可以如下实现通过导入编码能改变半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的代谢途径的酶的基因表达盒，尤其是通过增加木聚糖的比例和/或减少和/或增加糖醛酸含量。
根据本发明，参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸生物合成的目标酶选自含有下述成员的组肌醇1-磷酸合酶(EC5.5.1.4)，肌醇单磷酸酶(EC3.1.3.25)，肌醇加氧酶(EC1.13.99.1)，β-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.31)，葡糖醛酸激酶(EC2.7.1.43)，葡萄糖苷酸基转移酶(EC2.4.1.17)，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC2.7.7.44)，磷酸葡糖变位酶(EC5.4.2.2)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.9)，UDP-葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.22)，UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC4.1.1.35)，1，4-β-D-木聚糖合酶(EC2.4.2.24)和纤维素合酶(EC2.4.1.1)。
在上面的段落中，引用的″E.C.″和后面的数字指酶的IUBMB(国际生化分子和生物学联合会)命名。
更具体地，根据本发明的目标酶选自肌醇加氧酶(EC1.13.99.1)，β-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.31)，葡糖醛酸激酶(EC2.7.1.43)，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC2.7.7.44)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.9)，UDP-葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.22)和UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC4.1.1.35)。
本发明的另一个目的是，从根据本发明的遗传修饰的植物获得的具有不同于本领域水平的化学质量和物理性质的木材，其允许工业加工成本的显著降低和终产物(例如纸)的改进，也用于土木工程、造船、家具生产、器械、以及纤维素浆生产，尤其用于纤维素浆和纸生产。
除了桉树外，本发明还指向被子植物和裸子植物内的其它植物，例如小麦，例如，从小麦提取的全麦粉，小麦细胞壁上存在大量的纤维。也可以提及棉花，也可以观察到它的变化，因为棉花几乎排它地由纤维素组成。有义或反义cDNA表达与半纤维素生物合成的主要酶的代谢活性以及细胞壁组成的变化直接相关。
在树木的特定情况下，半纤维素保留允许用独特的表面组成获得具有差别的物理机械性能和纤维的浆，所述表面组成影响打印纸和包装和吸收纸的特性。除了影响产品特性外，半纤维素保留有利于造纸机的性能。
本发明的另一个目的是，从来自遗传修饰的植物的木材获得的纤维素，和所述纤维素在纸生产中的应用，其可以用于尤其是土木工程、家具工业、打印纸、包装和吸收纸。优选地，来自本发明的修饰的纤维素的纸可以用作打印、包装和吸收纸。
此外，本发明的另一个目的是遗传修饰的种子，其存在一种或多种编码本发明的目标酶的基因表达盒，和这些种子在获得遗传修饰的植物中的应用。
本发明的另一个目的是，提高生产过程中的纤维素产率，以及改变原色和漂白的纤维素浆质量，调控修饰的植物的糖醛酸和/或纤维素和/或半纤维素含量。
转基因方法的使用与常规的植物改良计划有关，其加速获得具有用于工业部门的特定的且需要的特征的产品的过程，其与森林改良和植物遗传改良有关。
近来，已经从猪肾cDNA库克隆了酶——肌醇加氧酶(Arner等人，2001.″Myo-inositol oxygenasemolecular cloning andexpression of a unique enzyme that oxidizes myo-inositol andD-chiro-inositol″.Biochem.Journal，360(2)313-320)。该序列用作引物合成的基础，所述引物用于扩增桉树基因组中存在的正向同源区域，从而促进miox基因在树基因组中的定位。从大肠杆菌中克隆了目标酶β-葡糖苷酸酶，并以有义和反义方向在大桉(Eucalyptusgrandis)中表达。
根据本发明，通过上述方法获得的术语“遗传修饰的植物”包括细胞、器官、组织、种子、完整的植物或它的后代。
根据本发明，“衍生的植物”指源自具有一种或多种编码本发明的目标酶的基因表达盒的遗传修饰的植物的植物。通过改变半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成的代谢途径，所述衍生的植物存在细胞壁的化学组成的改变。
根据本发明的术语“有义表达”和“反义表达”分别指编码目标酶的基因的过表达或抑制。
根据本发明，″基因表达盒″指，无论它们的结构如何，都包含编码本发明的目标酶的基因的表达盒。
本发明提出改变半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成，从而提高木材质量。为了理解已经用于本发明中的策略，必须知道半纤维素生物合成的生物化学和参与该过程的酶。
糖醛酐有利于木材蒸煮，通过保护半纤维素终止子基团，预防剥皮反应。糖醛酐和光学性质之间的关联表明，这些组分形成发色的化合物，其在常规漂白后赋予浆褐色，从而在漂白过程中消耗更多的氧化剂。从这些结果，申请人已经开发了本发明的技术，试图获得具有改变的木聚糖和糖醛酐浓度的植物，更具体地是树。
和使用的术语从下面描述的一些术语和构成本发明的一部分的附图，可以更好地理解本发明。
a)E-值″期望值″-识别随机发生的背景，其存在于核苷酸序列之间的比对中。E-值越低，或越接近0，序列之间的比对更明显。但是，对于短序列，如在引物序列分析的情况下可以观察到的，实际上相同的序列可以发生高E-值。在该情况下，E-值估计会考虑目标序列的长度，因为短序列具有在数据库中纯粹随机发生的高可能性。
b)Gi号NCBI(国家生物技术信息中心)数据库中的基因的登记号。
c)ORF与c-DNA相对应的″开放阅读框″。
d)Bit Score在NCBI的BLAST系统的统计分析中使用的比对的版本级别。
e)串通过同源性在组中组织的序列。
f)EST″表达的序列标签″-短cDNA序列(互补的DNA)。
g)FASTA非格式化的文本，但是具有断线，每行含有60个字符。通过序列比对用于在数据库中搜寻序列使用的渐进序列的算法对比的标准模型。
h)FRAME NUMBER出现在具有基因大小的DNA片段中的可能的阅读框(在每种意义有3个+1，+2，+3，-1，-2，和-3)，从起始密码子ATG开始，以终止密码子(TAA，TAG，或TGA)结束。
i)nptII胭脂碱磷酸转移酶II基因，其能赋予对卡那霉素的抗性(Bevan等，1983)；j)htp潮霉素B磷酸转移酶基因，其能赋予对潮霉素的抗性(van den Elzen等，1985)；
k)barphosphinothricin(bialaphos)乙酰基转移酶基因，其能赋予对草铵膦(ammonium glufosinate)的抗性(Thompson等人，1987)；l)BLAST-″基本的局部比对搜索工具″Altschul等，(1997)″Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of proteindataba sesearch programs″.Nucleic Acids Research，253389-3402；m)BLAST N对比要针对可从NCBI数据库获得的核苷酸序列进行分析的核苷酸序列。
n)BLAST X对比要针对可从NCBI数据库获得的蛋白序列进行分析的翻译的核苷酸序列。
o)BLAST 2序列进行2个或多个核苷酸或蛋白序列的多个比对的对比分析。
图1显示了获得纤维素、半纤维素和葡糖醛酸的几个代谢途径。整个过程的关键代谢物是UDP-葡萄糖，其用作蔗糖、纤维素和半纤维素合成的原料，因而是几种化合物中碳分配的重要组分。
图1也显示了酶的名称，和它们的国际编码(E.C.)，其由已经在本发明中分离的基因编码，尤其是EC5.5.1.4，肌醇1-磷酸合酶(MIPS)；EC3.1.3.25，肌醇单磷酸酶(IMP)；EC1.13.99.1，肌醇加氧酶；EC3.2.1.31，β-葡糖苷酸酶；EC2.7.1.43，葡糖醛酸激酶；EC2.4.1.17，葡萄糖苷酸基转移酶；EC2.7.7.44，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶；EC5.4.2.2，磷酸葡糖变位酶；EC2.7.7.9，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；EC1.1.1.22，UDP-葡萄糖脱氢酶，EC4.1.1.35，UDP-D-葡糖醛酸羧化酶；EC2.4.2.24，1，4-β-D-木聚糖合酶，EC2.4.1.1，纤维素合酶。
显示了从葡萄糖-6-P糖形成木聚糖和葡糖醛酸的示意图，和在前面的段落中引用的酶的氧合途径的示意图。空白框指示其基因尚未从任何生物克隆和测序的酶。
在植物中导入基因表达盒的方法下面给出的描述仅仅用于解释和示例目的，而非限制性的，分离参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸生物合成的本发明的一些基因的方法，无论它们可能具有的任何变化1)UDP-葡萄糖脱氢酶基因(EC1.1.1.22)；2)酶——UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC4.1.1.35)的uxs1基因；3)酶——肌醇加氧酶(EC1.13.99.1)的miox基因；4)酶——UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.9)的基因；5)酶——葡糖醛酸激酶(EC2.7.1.43)的基因；6)酶——葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC2.7.7.44)的基因；使用NCBI(国家生物技术信息中心)数据库中的EC号(酶码)，在网站www.ncbi.nlm.nih.gov(其搜集了可用于研究的已经测序的生物的核苷酸序列)进行搜索。提供了用于分析的链接，例如A)BLAST N对比要针对可从NCBI数据库获得的核苷酸序列进行分析的核苷酸序列。
B)BLAST X对比要针对可从NCBI数据库获得的蛋白序列进行分析的翻译的核苷酸序列。
C)BLAST 2序列进行2个或多个核苷酸或蛋白序列的多个比对的对比分析。
结果允许获得上述酶的编码基因的序列，如下1)EC1.1.1.22来自Glycine max(大豆)的酶——UDP-葡萄糖脱氢酶的基因(Gene Bank登记号U53418)。
2)EC4.1.1.35来自Pisun sativum(豌豆)的酶——UDP-D葡糖醛酸羧化酶的uxs1基因(Gene Bank登记号BAB409674)。
3)EC1.13.99.1来自野猪(Sus scrofa)的酶——肌醇加氧酶的miox基因(Gene Bank登记号AAL39076)。
4)EC2.7.7.9来自马铃薯(Solanum tuberosum)的酶——UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因(Gene Bank登记号U20345)。
5)EC2.7.1.43编码酶——葡糖醛酸激酶的基因。
6)EC2.7.7.44编码酶——葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因使用BLASTP，可以对比目标序列和蛋白数据库。在该选择内，使用针对含有蛋白家族的CDD(″保守的结构域数据库″)数据库的CDS(″保守的结构域搜索″)，可以对比保守的蛋白结构域。
对于上述的所有酶，在活生物的基因组中发现了基因序列，CDS表明结构域的高度蛋白同源性和保守。
鉴别了每个基因的候选序列后，在允许设计特定核苷酸序列的特异性的引物的Primer 3程序(见例如网站www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html，或www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)的帮助下，将这些序列用于合成每个ORF的特异性的引物。使用PCR(聚合酶链反应)技术，将这些引物用作扩增有关基因的完整编码区的引发剂。将PCR反应获得的产物测序，并在BLAST程序的帮助下，针对NCBI数据库，进行鉴别确认。该PCR产物用作DNA印迹技术的探针，以证实该序列在植物基因组中的存在。
使用与上述的酶相对应的ORF(开放阅读框)搜索，进行目标基因的分离，独立于它们可能具有的任何变化，用于它们随后的在向双载体中的克隆，焦点集中在称作Gateway的载体上，其来自美国公司Invitrogen Corporation，但不限于该载体。合成了引物，并使用NCBIBLAST程序，从这些基因的核苷酸序列预测了每种酶对应的ORF大豆的UDP-葡萄糖脱氢酶，豌豆的UDP-D-葡糖醛酸羧化酶，马铃薯的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，和野猪的肌醇加氧酶。
使用土壤杆菌-介导的植物转化技术，将含有目标基因的表达盒克隆进用于植物转化、用于在植物中过表达或抑制该基因的双载体，把焦点集中在烟草属和桉树属植物。
酶——UDP-葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.22)，UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC 4.1.1.35)，肌醇加氧酶(EC 1.13.99.1)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9)，葡糖醛酸激酶(EC 2.7.1.43)，和葡糖醛酸-1-磷酸(EC 2.7.7.44)的基因序列用于合成特定的引物，包括这些基因的完整序列。将反应产物测序，并在NCBI BLAST程序的帮助下，进行鉴别确认。使用Invitrogen“用于cDNA合成和克隆的Gateway技术的SuperScriptTM质粒系统”试剂盒，根据生产商的建议，将作为RT-PCR产物获得的所述酶的cDNA克隆进尤其是Gateway载体中(Karimi等人，(2002)″GatewayTMvectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.″Trends Plant Science，7(5)193-195)。
如在使用Gateway技术的克隆方法中，在Invitrogen的GatewayLR ClonaseTM介导的反应中，通过att重组位点侧连接PCR产物，它可以以有义或反义方向定向地克隆进该载体中，其含有相容的重组位点。
Gateway双载体已经具有用于转化体选择的标记基因nptII，htp，或bar。所有这些选择基因处于位于T-DNA的左边界的nos启动子和终止子，胭脂碱合成酶的转录控制下(Hellens等，(2000)″pGreena versatile and flexible binary Ti vector forAgrobacterium-mediated plant transformation.″Plant MolecularBiology，42819-832)。目标片段插入的重组位点位于T-DNA的右边界。
在克隆进Gateway载体的特定情况下，使用位于T-DNA右边界、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的启动子和终止子之间的克隆位点，进行酶的cDNA序列的过表达或抑制(Odell等人，(1985)″Identification of DNA sequences required for activity of thecauliflower mosaic virus 35S promoter″.Nature，313810-812p)，以及其它启动子。
通过增加编码酶UDP-葡萄糖脱氢酶的ugd基因的表达，可以改变木聚糖生物合成。该酶被认为是关键酶，因为它调节生成淀粉和蔗糖的碳流，且它也受肌醇可用性的调节。
因而，在本发明的一个实施方案中，克隆了来自大桉的UDP-葡萄糖脱氢酶的ugd基因，以在烟草属和桉树属植物和其它目标植物中过表达该基因。
在另一个实施方案中，克隆来源于树的负责生产酶——UDP-D葡糖醛酸羧化酶的uxs1基因的目的是，用于改变树和植物中的UDP-D-木糖生产。因此，可以评价过表达该基因对细胞壁形成的影响，和对植物的发育的影响。
UDP-D-木糖(半纤维素合成的一种重要前体)生物合成由酶——UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC 4.1.1.35)介导，后者能在可逆反应中将UDP-D-葡糖醛酸转化成UDP-D-木糖(Bar-Peled等，(2001)″Functional cloning and characterization of a UDP-glucuronicacid decarboxylaseThe pathogenic fungus Cryptococcusneoformans elucidates UDP-xylose synthesis″.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，98(21)12003-12008)。
由于改变半纤维素生物合成的代谢调节的目的，本发明的一个目的是，克隆来源于树和植物的负责靶酶生产的基因，从而以后影响这些基因在细胞壁多糖生物合成和在烟草植物(Nicotinana tabacum)和树的发育中的过表达或抑制，焦点集中在桉树属，除了其它植物外。
根据本发明，图1进一步解释了该方法，该图示意性地显示了半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成的代谢途径，以及从糖——葡萄糖6-P形成木聚糖和葡糖醛酸，和肌醇的氧合途径。
在另一个方面，本发明涉及调控植物中的多肽水平的方法，所述多肽参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成，其特征在于下述阶段a)向植物细胞中导入一种或多种基因表达盒，其包含一种或多种编码一种或多种选自下述的酶的基因肌醇1-磷酸合酶(EC5.5.1.4)，肌醇单磷酸酶(EC3.1.3.25)，肌醇加氧酶(EC1.13.99.1)，β-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.31)，葡糖醛酸激酶(EC2.7.1.43)，葡萄糖苷酸基转移酶(EC2.4.1.17)，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC2.7.7.44)，磷酸葡糖变位酶(EC5.4.2.2)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.9)，UDP-葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.22)，UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC4.1.1.35)，1，4-β-D-木聚糖合酶(EC2.4.2.24)和纤维素合酶(EC2.4.1.1)；b)再生植物细胞；c)在足够的时间内，诱导所述多肽的表达，以调控所述植物中的半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成水平。
实施例下面的实施例仅仅用于以示例的方式解释本发明的某些具体的实施方案。但是，它们不应当理解为对它们的更宽范围的限制，该范围仅仅由所附权利要求书界定。
实施例1总RNA分离在该实施方案中，在SALZMAN，R.A，FUJITA，T.，ZHU-SALZMAN，K.，HASEGAWA，P.M.，BRESSAN，R.A.(1999)(An Improved RNAIsolation Method for Plant Tissues Containing High Levels ofPhenolic Compounds or Carbohydrates-Plant Molecular BiologyReporter 1711-17，1999)的方法的帮助下，获得了总RNA。
从桉树根分离了总RNA。将浸泡在液氮中的桉树根转移到提取缓冲液，然后用比例为24∶1(v/v)的氯仿/异戊醇提取2-3次，并离心分离水相和有机相。在-20℃，用NaCl和乙醇沉淀剩余在水相中的蛋白和碳水化合物至少3小时。向从前述沉淀获得的上清液中加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)后，进行离心，从有机相分离水相。在-20℃，用NaCl和乙醇进行第二次沉淀，也至少3小时。将含有总RNA的沉淀重新悬浮到DEPC(二乙基焦碳酸酯)水中，然后用氯化锂沉淀。在80％乙醇中洗涤沉淀，然后通过分光光度法，在260nm波长定量，并在1×缓冲液TAE中的1％琼脂糖凝胶中验证。
实施例2
信使RNA提取(mRNA)根据生产商的标准，使用美国公司DYNAL Biotech的称作″Dynabeads″的mRNA纯化试剂盒，分离信使RNA。
实施例3特异性的引物合成将序列CACC连接到紧挨超表达的基因(UDP-葡萄糖脱氢酶，UDP-D-葡糖醛酸羧化酶，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)的有义引物序列的5′区域前面，即连接翻译起始密码子。
将序列CACC连接到紧挨肌醇加氧酶基因的反义引物序列的3′区域后面，即连接翻译终止密码子。
实施例4cDNA合成根据生产商的标准，使用称作″SuperScriptTMOne-Step RT-PCRwith Platinum Taq″的Invitrogen试剂盒，在单一步骤中，完成cDNA合成和之后用与这些基因的ORF的相对应的特异性的引物扩增。
实施例5RT-PCR反应产物克隆根据生产商的标准，使用称作″pENTR-Directional TOPO CloningKit″的Invitrogen试剂盒，克隆由用特异性的引物(其能完全侧接ORF的)进行扩增反应获得的产物。
实施例6LR CLONASE重组反应在该特定情况下，pENTR载体的嵌合构建体和用于植物转化的Gateway双载体之间的重组反应，由Invitrogen的LR Clonase(Karimi，M.等人，同上)介导。
实施例7转化方法根据巴西专利申请PI0003908，从Physiologic GeneticsLaboratory of the Genetics Department of the Superior Schoolof Agriculture″Luiz de Queiroz″of the University of Paulo(USP)建立的桉树获得遗传修饰的植物的方法，使用根瘤土壤杆菌-介导的植物转化方法来导入基因。使用的植物材料是桉树种子。将种子灭菌，然后播种在MS(Murashige和Skoog，1962)培养基中，它们在其中保持15天，直到胚芽发育。这些胚芽的子叶是要接种根瘤土壤杆菌的外植体。除了目标基因外，使用的构建体具有对抗生素卡那霉素选择抗性的NPTII基因。在24小时中，将细菌培养在液体AB培养基中，直到它达到接近0.8(OD660nm)的光密度。用细菌培养物接种从胚芽抽出的子叶6小时。该阶段后，将外植体转移到固态MS培养基，培养48小时。然后，将子叶转移到愈伤组织形成培养基(含有5μM TDZ和5μM ANA的MS)，其含有50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢噻肟。将已经发育的愈伤组织转移到含有25mg/L卡那霉素的芽形成培养基(含有5μM TDZ和2.5μM ANA的MS)。表现出令人满意的发育的芽会伸长和生根。然后，将从这些芽发育的植物保持在温室的温度、湿度和光线的控制条件下。使用转化体的基因组DNA，通过DNA印迹技术，证实了转基因的存在。
实施例8a)通过RNA印迹，完成了转基因图谱表达的测定。根据实施例5，从转化体植物(源自独立的转化事件)分离总RNA。通过RNA印迹，分析RNA样品，以测定与独立的转化事件有关的每个转基因的图谱表达。
b)转化的植物的获得和生长后，测定木聚糖和葡糖醛酸的浓度水平。
权利要求
1.基因表达盒，其特征在于，它包含一种或多种编码一种或多种选自含有下述成员的组的酶的基因肌醇1-磷酸合酶(EC5.5.1.4)，肌醇单磷酸酶(EC3.1.3.25)，肌醇加氧酶(EC1.13.99.1)，β-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.31)，葡糖醛酸激酶(EC2.7.1.43)，葡萄糖苷酸基转移酶(EC2.4.1.17)，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC2.7.7.44)，磷酸葡糖变位酶(EC5.4.2.2)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.9)，UDP-葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.22)，UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC4.1.1.35)，1，4-β-D-木聚糖合酶(EC2.4.2.24)和纤维素合酶(EC2.4.1.1)。
2.根据权利要求1的盒，其特征在于，所述组含有肌醇加氧酶(EC1.13.99.1)，β-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.31)，葡糖醛酸激酶(EC2.7.1.43)，葡糖醛酸-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC2.7.7.44)，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.9)，UDP-葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.22)，和UDP-D-葡糖醛酸羧化酶(EC4.1.1.35)。
3.根据权利要求1的盒，其特征在于，被克隆进转化双载体，并导入细菌根瘤土壤杆菌。
4.根据权利要求1的盒，其特征在于，所述酶参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成。
5.根据权利要求4的盒，其特征在于，半纤维素是木聚糖。
6.根据权利要求4的盒，其特征在于，糖醛酸是葡糖醛酸。
7.一种或多种基因表达盒的应用，其特征在于，它用于过表达或抑制权利要求1所述的基因。
8.遗传转化植物细胞的方法，其特征在于，将根据权利要求1-6中的任一项的一种或多种盒导入植物基因组。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，通过电穿孔、生物轰击、显微注射、宏观注射或通过根瘤土壤杆菌，将盒导入细胞中。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，通过根瘤土壤杆菌将盒导入细胞中。
11.根据权利要求8的方法，其特征在于，改变半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成的代谢途径。
12.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述植物细胞是来自植物的任意部分的细胞，例如根、茎、果实、叶、种子或花。
13.获得遗传修饰的植物的方法，其特征在于，包含下面的阶段a)遗传转化根据权利要求8-12中的任一项的植物细胞；b)再生阶段(a)细胞；(c)以足够的量表达导入阶段(b)的细胞中的DNA，基本上改变半纤维素和/或纤维素和/或糖醛酸的生物合成的代谢途径；和d)获得修饰的植物。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，所述修饰的植物是细胞、器官、组织、种子、完整的植物或它的衍生植物。
15.遗传修饰的植物，其特征在于，含有根据权利要求1-6中的任一项的一种或多种表达盒。
16.遗传修饰的植物，其特征在于，源自根据权利要求13的方法。
17.根据权利要求15或16中的任一项的植物，其特征在于，是被子植物。
18.根据权利要求15或16中的任一项的植物，其特征在于，是裸子植物。
19.根据权利要求17的植物，其特征在于，是桉树属植物。
20.根据权利要求15-19中的任一项的植物的应用，其特征在于，用于获得木材和/或纤维素。
21.衍生的植物，其特征在于，源自根据权利要求15或16中的任一项的遗传修饰的植物。
22.遗传修饰的种子，其特征在于，包含根据权利要求1-6中的任一项的一种或多种表达盒。
23.权利要求12所述的遗传修饰的种子，其特征在于，包含根据权利要求1-6中的任一项的一种或多种表达盒。
24.从权利要求13的方法获得的遗传修饰的种子，其特征在于，存在纤维素、半纤维素和/或糖醛酸的生物合成的变化。
25.根据权利要求22或23中的任一项的遗传修饰的种子的应用，其特征在于，用于产生植物。
26.木材，其特征在于，从根据权利要求15或16中的任一项的遗传修饰的植物获得。
27.从根据权利要求15或16中的任一项的遗传修饰的植物获得的木材的应用，其特征在于，用于土木工程、造船、家具和用具生产和用于生产纤维素浆和纸。
28.根据权利要求27的木材的应用，其特征在于，用于生产纤维素浆和纸。
29.纤维素，其特征在于，从根据权利要求26的木材获得。
30.从根据权利要求26的木材获得的纤维素的应用，其特征在于，用于生产纸。
31.纸，其特征在于，从分别根据权利要求26或29中的任一项的木材或纤维素获得。
32.从分别根据权利要求26和29中的任一项的木材或纤维素获得的纸的应用，其特征在于，用于土木工程、家具工业、打印纸、包装和吸收纸。
33.从分别根据权利要求26和29中的任一项的木材或纤维素获得的纸的应用，其特征在于，用于打印纸、包装和吸收纸。
34.调控植物中的多肽水平的方法，所述多肽参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成，其特征在于，包含下述阶段a)向植物细胞中导入根据权利要求1的一种或多种基因表达盒；b)再生植物细胞；c)在足够的时间内，诱导所述多肽的表达，以调控所述植物中的旱纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成水平。
全文摘要
本发明涉及编码参与半纤维素、纤维素和/或糖醛酸的生物合成代谢途径的酶的基因表达盒，并涉及通过导入一种或多种本发明的基因表达盒来遗传转化植物细胞的方法，和这些基因在植物中的过表达和抑制。更具体地，本发明涉及将表达盒导入植物的方法。另外，本发明涉及遗传修饰的植物。本发明还涉及获得经遗传修饰的植物、其衍生的植物和种子，以及来自该植物的木材、纸和纤维素。
文档编号C12N9/00GK1910285SQ200580003001
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月21日 优先权日2004年1月22日
发明者C·A·拉贝特, M·T·V·拉贝特, A·L·伯特罗, D·D·纳斯曼托, G·古特马尼斯, M·I·F·法拉尔多 申请人:苏扎诺纸张和纤维素公司, 路易斯·德凯罗斯土地研究院, 圣保罗国情研究援助基金会