专利名称：一株产l－丝氨酸的菌株及用该菌株生产l－丝氨酸的方法
技术领域：
一株产L-丝氨酸的菌株及用该菌株生产L-丝氨酸的方法，本发明涉及以蔗糖、硫酸氨为主要原料，利用该菌株发酵生产L-丝氨酸的方法。属于生物法制备氨基酸技术领域。
背景技术：
L-丝氨酸属非必需氨基酸，是一种生糖氨基酸。它具有重要的生物学意义，是合成多种氨基酸、嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体，其衍生物磷脂丝氨酸是磷脂主要成分之一。它被广泛的应用于食品，医药及化妆品领域，作为氨基酸输液剂的主要成分，及作为抗癌药物，抗艾滋病药物等已在医药领域受到人们的关注；在化妆品领域，作为一种天然的保湿因子，是许多高档化妆品的关键添加剂。
除发酵法外，L-丝氨酸的制备方法目前有提取法，化学合成法，酶法等。这些方法存在操作费时，收率低，拆分困难，环境污染严重，不适于大规模生产等问题。
L-丝氨酸处于氨其酸代谢的中间位置，参与许多生物物质(如甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸等氨基酸，嘌吟、胸腺嘧啶之类的核酸碱基，磷脂丝氨酸、鞘磷脂等磷脂)的合成，代谢运转速度极快。因此与其它氨基酸相比，直接发酵法生产L-丝氨酸十分困难。至今研究的大多是以甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸为前体的发酵法。其中以甘氨酸为前体生产L-丝氨酸生产技术已经工业化，但添加的前体物价格偏高，因而成本高、价格较贵。
直接发酵法主要是利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸。但L-丝氨酸是氨基酸代谢的中间产物，参与许多生物物质如甘氨酸、半胱氨酸、核酸碱基等的合成。因此，L-丝氨酸在生物体内很难大量积累，成为利用糖类发酵生产L-丝氨酸的一个瓶颈。国内，新疆农科院微生物所崔春生等人利用基因工程菌Brevibacteriumflavm直接发酵生产L-丝氨酸。国外，没有查阅到直接发酵法生产L-丝氨酸的相关报道。Petra Peters-Wendisch等人成功的采用代谢工程的手段，利用谷氨酸棒杆菌构建了L-丝氨酸的产生菌，为进一步研究丝氨酸代谢途径奠定了基础。利用此类重组菌生产L-丝氨酸时，很难进行工艺放大，难以实现产业化。
从工业化角度看，要求生产L-丝氨酸的菌株遗传稳定性好，且产生的杂酸少，L-丝氨酸产量达一定水平，工艺放大较为容易，这样才能适合于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产L-丝氨酸的菌株及用该菌株生产L-丝氨酸的方法，其中包括菌株的筛选以及在适宜条件下培养该菌株大量生产L-丝氨酸。
本发明所述的一株产L-丝氨酸的菌株，该菌株分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1843。
本发明中的L-丝氨酸的生产菌株可以这样筛选得到采集土样，在富集培养基中对细菌进行富集培养。用茚三酮的显色反应在平板中检出具有变色圈的菌株；使用摇管初筛及摇瓶复筛最终筛选得到L-丝氨酸的生产菌。
该菌株的筛选方法(1)采集土样采集糖厂周围土样。
(2)富集采集的土样在装有含制霉菌素的富集培养基中富集培养。
(3)检出氨基酸产生菌用茚三酮显色反应在平板中检出具有变色圈的菌株。
筛选固体培养基葡萄糖20～40g/L，(NH4)2SO410～40g/L，KH2PO41～5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，FeSO4·7H2O 0.02～0.15g/L，MnSO4·H2O 0.02～0.15g/L，生物素30～50μg/L，硫胺素200～250μg/L，琼脂20g/L。
培养条件为30～35℃，1～4天。
(4)L-丝氨酸产生菌的筛选在摇管中对检出的菌株进行初筛，筛选得到具有L-丝氨酸生产能力的菌株。再进行摇瓶复筛，得到产量性状较优的菌株。
筛选发酵培养基葡萄糖40～80g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～.0g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，CaCO320g/L。
培养条件为30～35℃，摇瓶转速为往复90～120转/分，2～5天。
用于本发明的L-丝氨酸生产菌具有以下分类学特征菌落呈圆形，表面光滑，颜色微黄；显微细胞形态为短杆状，呈单或成八字形排列；好氧；无芽孢、鞭毛，不运动，革兰氏阳性；不能利用葡萄糖产酸，硝酸盐还原试验阳性，甲基红试验阳性，V.P.试验阴性，不能水解明胶，不能利用尿素，可利用无机氮源。经16Sr DNA鉴定，结合分类学鉴定结果，该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062。
本发明用通风发酵的方式培养微生物SYPS-062进行L-丝氨酸的生产。作为培养基需要有适当的碳源、氮源、无机物及所需的痕量其它营养物质和无机盐。
用CGMCC No.1843菌株生产L-丝氨酸的方法，发酵培养基为蔗糖50～70g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，VB1500μg/L，CaCO320g/L，pH 6～8，121℃下灭菌20min。将菌株以5％-10％(w/w)接种量转接到发酵培养基中，培养在通气条件下进行，如摇瓶培养或搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30～35℃左右，摇床转速90～120转/分钟，或发酵罐通风量2～3vvm，搅拌转速为400～600转/分钟。培养pH6～8范围内，pH值中性左右。可选用碳酸钙、氨、无机酸碱溶液调节pH值。通常培养72-120h，L-丝氨酸在发酵液中积累。
发酵培养基中的蔗糖可以改用葡萄糖或果糖。
本发明的有益效果从自然界中筛选得到能够利用糖质原料直接发酵积累L-丝氨酸的产生菌，经鉴定为谷氨酸棒杆菌。在优化条件下培养生产L-丝氨酸，产酸水平达到5～7g/L。现有的生产L-丝氨酸的方法中，多为前体发酵法，而本发明提供直接发酵生产L-丝氨酸的菌株，这样就大大降低了生产L-丝氨酸的成本，提高了收益。本发明菌株具有遗传稳定性好、产量性状稳定，L-丝氨酸产量保持较高水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。
图1发酵培养基中不同浓度的蔗糖对L-丝氨酸产量的影响。
生物材料样品保藏谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062，保藏日期2006年10月20日，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1843。
具体实施例方式
实施例1筛选具有L-丝氨酸合成能力的菌株。
采集糖厂周围的表面15cm以下的土样，1g土样在装有含有50μg/mL制霉菌素的富集培养基三角瓶(30mL/250mL)中于往复式摇床中30℃ 110rpm/min富集培养3天。将富集得到的菌悬液取0.1mL涂布于筛选培养基，使用灭过菌的滤纸片将涂布的平板影印至拷贝平板，培养3天。使用0.3％的茚三酮的丙酮溶液浸润平板，于105℃烘干显色10min，产生紫色变色圈的为氨基酸产生菌。
从拷贝平板挑取相应的氨基酸产生菌，在发酵培养基中进行摇管初筛，每株一管。培养结束后，用纸层析法检测发酵上清液中的L-丝氨酸含量，初筛得到6株有丝氨酸合成能力的菌株。
再进行摇瓶复筛，首先经种子培养，再以接种量5％(v/v)接入发酵培养基，每株三瓶，用氨基酸分析仪检测发酵上清液中L-丝氨酸的含量，结果见表1。其中菌株SYPS-062的产量最高，达2.9g/L。经过传代实验考察，具有较好的传代稳定性。
种子培养基(g/100mL)葡萄糖3.0，玉米浆2.0，(NH4)2SO42.0，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，尿素0.15，豆饼水解液2.0，pH 7.0-7.2，121℃下灭菌20min，装液量20mL/250mL。
发酵培养基葡萄糖80g/L，玉米浆30g/L，棉籽粉30g/L，(NH4)2SO430g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，生物素0.08mg/L，CaCO320g/L。培养条件为30℃，摇瓶转速为往复110转/分，培养3天。
表1
实施例2选择发酵培养基的最适碳源种类及浓度。
以实施例1中的发酵培养基为基础培养基，将其中的葡萄糖换为80g/L蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、淀粉等碳源，结果见表2。在以葡萄糖、蔗糖或果糖为碳源时，L-丝氨酸的产量较高；而以乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉为唯一碳源时，几乎不产L-丝氨酸。其中以蔗糖为碳源时，L-丝氨酸的产量最高，为5.1g/mL。
并且以蔗糖为碳源，生产强度亦最高。表2
实施例3以40-80g/L不同浓度的蔗糖为碳源进行发酵。
实验结果见图1所示。以60g/L为最优浓度，L-丝氨酸产量可达到5.5g/L。
实施例4 VB1对菌体生长和L-丝氨酸积累有较大影响。
在发酵培养基蔗糖60g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，CaCO320g/L的基础上，分别添加50μg/L、200μg/L、500μg/L、800μg/L的VB1，发酵罐通风量2～3vvm，搅拌转速为400～600转/分钟，培养pH6～8范围内。结果表明，500μg/L为最优浓度，L-丝氨酸产量可达6.0-6.4g/L。与未加VB1比较提高了20％左右。
权利要求
1.一株产L-丝氨酸的菌株，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)SYPS-062，保藏编号为CGMCC No.1843，该菌株具有以下特性能利用糖质原料直接发酵生产L-丝氨酸。
2.一种利用权利要求1所述菌株CGMCC No.1843生产L-丝氨酸的方法，其特征在于发酵培养基为蔗糖50～70g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，VB1500μg/L，CaCO320g/L，pH 6～8，121℃下灭菌20min；将菌株以5％-10％(w/w)接种量转接到发酵培养基中，在通气条件下，以摇瓶培养或搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30～35℃，培养时间为72～120小时，进行L-丝氨酸生产。
3.根据权利要求2所述的生产L-丝氨酸的方法，其特征是发酵培养基中的蔗糖改用葡萄糖或果糖。
全文摘要
一株产L－丝氨酸的菌株及用该菌株生产L－丝氨酸的方法，属于生物法制备氨基酸技术领域。本发明包括从土壤中富集，分离，并使用茚三酮的变色圈法检出，经初筛，复筛得到一株产L－丝氨酸的菌株(Corynebacteriumglutamicum)SYPS－062，保藏编号为CGMCC No.1843；及用该菌株能够利用糖质原料直接发酵生产L－丝氨酸的方法。在优化条件下培养生产L－丝氨酸，产酸水平达到6g/L左右。
文档编号C12R1/15GK1966704SQ200610097730
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月21日 优先权日2006年11月21日
发明者许正宏, 张晓娟, 许泓瑜, 窦文芳 申请人:江南大学