专利名称：一种玉米抗菌蛋白的基因及其编码蛋白的应用的制作方法
一种5^抗菌蛋白的基因及，皿白的J^
默领域
本发明涉及植物抗病基因的分离，DNA克隆技术和基因重组技术，以及克 隆菌株在植物杀菌齐轉生物农药方面的应用技术领域。 背景駄
禾拥植物组织中已经合成的生物蛋白实现农药生产应用的绿色与环保是现代 农药生产与生物防治研究的重^5开究课题。栽培植物及其农作物历经几百万年的 基因重组和自然选择都具有了比较完备的防卫系统，能够抵御来自于微生物的侵 染和危害，植物个体自身的生化反应过程产生了许多拮抗病原菌的化合物一一各 种蛋白、多肽、酯类、酚类的生化小分子，这些生化物质构成了植物的防卫反应 系统。从植物体中分离或者合成的这些抗病的化合物能够通过基因工程的方法和 人工合成的技术获得，并进一步应用到植物的防病治病当中。由于这些化合物的 产生来自于植物自身的合成产物，通常对人类和植物本身是没有危害的，其合成 产物不会对人体产生负面的影响，因此，具有环i斜寺点和对人体无害的植物化合 物生产是生物防治和药物生产的重要产业。
农作物的病害主要是由病毒、细菌和真菌引起的，其爆发流行已使农业生产蒙 受了巨大的经济损失。病害的防治从无机化学农药、有机化学农药到生物农药的发
展，农业禾4SA员开展了大量深入而细致的研究。这些研究包括病毒致病过程、化 学防治技术、植物抗病机制及抗病品种培育等。随着分子病理学研究的深入， 在现代分子生物学和植物基因工程技术之上的抗病基因工程研究丰富了植物抗病 研究的理论基础，推动了植物病害防治和生物农药的发展。
从大麦、黑麦、小麦等作物中提取的一种失活蛋白均对粗糙脉胞菌原生质体的 生长有明显的抑制作用。在体外实验中，苽篓的抗菌蛋白辦种不同的真菌都有抑
制作用。大麦抗菌蛋白ME1和ME2对不少病原真菌和非病原真菌具有很强的抑制作用，尤其对丝孢菌类真菌(hyphomycete)有效，如棉花大丽轮枝菌(歸c做, Kleb)、茄禾斗早疫病(爿/teman'a ra/a", Jones改Grout)、黄瓜枯萎病菌 CF;^sa/7'w附oj^sporw附/Cwc腦e"'rwm.)、杨掛湿心病菌CFwra"', ，o騰ra/wm (Mat.)Nirenberg)、里氏木霉(7Hc/7cxierma陀eseO禾口7Hc/k dbmjf/kj^z/"", Rifai; ^ME1和ME2处理后隔膜增多、菌丝变细、菌丝尖端膨大裂解。Hypsin可抑制不同 种类真菌的菌丝体生长，如花生褐斑病(1^^0^/2^化//0<^^/2^//0 /" Jenkins)、苹果 f&i^病(尸/ yra/aspora; /n'co/a Nose)、尖f包,廉刀菌(F泌an'wm an^sporww Schlecht)禾口灰 葡萄孢菌(Bo吵fe c7'"ema Pers.); Lyophyllin^t真菌(/V vra/aspora ; zWco/a禾口鸡腿燕 Cop")ms co脂^(MulLFr.)Gray)有抗性。
研究证明，M基因克隆和基因工程实施抗菌蛋白分离和合成，能有效地避免 过量施用农药所造成的环境污染，为植物病害的生物防治开拓了广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于，应用现代的分子生物学技术，从玉米胚芽中分离和克隆 抗菌蛋白基因，通过基因克隆技术和基因重组技术，在原核中生物体中表达具有 功能的编码蛋白，获得无污染、有利于环境和人类健康的抗菌蛋白，并将其应用 于植物病害的防治和生物农药的生产领域。
本发明采用植物中存在的抗菌蛋白基因进行抗病基因工程的研究和开发。这 种抗菌蛋白对自身基因转录与蛋白的合成不起破坏作用，但能特异失活与其亲缘
关系较远的物种(如病原微生物)的核糖体功能，阻止多肽链的延伸，抑制蛋 白质合成，进而杀死细胞，使得侵染的微生物不能完成正常的侵染过程。大量的 研究结果表明，植物体中的抗菌蛋白具有多种抑制病原微生物活性的特点。
本发明所述的玉米抗菌蛋白基因是一种从玉米中提取的DNA，其编码蛋白的 产物是一种具有多种病原微生物抗性的抗菌蛋白。经过多年的研究，通过基因克 隆和基因工程的方法在大肠杆菌中會巨够大量的合成和表达这种抗菌蛋白，通过实 验研究证明它对一醜毒、细菌以及一些真菌都有不同禾號的抗性。本发明应用DNA重组技术和分子生物学方法，从玉米自交系108 (Z^ M《戸)中分离了一个长度为906bp的抗菌蛋白基因(以下简称为z/朋)，并在 大肠杆菌中表达了这段目的基因的编码蛋白，
本发明是由以下技术方案实现的1)分离了一种抗菌蛋白基因；2)在 大肠杆菌中表达了该基因的编码蛋白。该抗菌蛋白的基因即为从玉米(Z^ 中分离并克隆的一个长度为906bp的抗菌蛋白基因W朋，该基因片断 的核苷酸序列为SEQ NO.l所示的315-1220bp之间的片断(见本说明书第9 页至第13页)，其长度从ATG到TGA为906bp。其编码蛋白长度为301个 氨基酸，其分子量为33.252KDa，氨基酸序列如SEQ N0.2所示(见本说明书 第14页)。
所述的长度为906bp的抗菌蛋白基因W朋，其插入到克隆载体pBS-T中 时，获得了含有z/朋基因扩增片断的重组DNA质粒pBS-T(W朋)。质粒pBS-T (W朋)包含有长度为906bp的抗菌蛋白基因W朋，该基因片断经限制性内 切酶(例如/5WI)再次酶切、连接在表达载体pET30(+)a中，获得 克隆质粒pET/91-108，该质粒经转化大肠杆菌BL21(DE3)获得克隆 菌株pET/91-B108，该菌珠已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，该保藏中 心地址为中国武汉武汉大学，其菌种保藏号CCTCC NO: M207179,菌 种保藏日为2007年11月14日；其菌株含有质粒pET/91-B108包含有长度为 906bp抗菌蛋白基因。
上述基因分离和克隆的具体操作方法可参照现有技术，例如参照本发明 人申请的专利号为200510042560.4的中国专利中所述的具体方法。
含有质粒pET/91-108的菌株pET/91-B108包含有长度为906bp抗菌蛋白 基因z7朋。在37'C条件下、以LB培养基培养能够获得基因z/朋表达的编码 蛋白，该蛋白具有抑制芽孢杆菌(5"c说ws sw^/fc)、番茄灰霉病(Bof^y他c/"em Pers.)、辣椒根腐病(Fwran'ww so/a"/)、番茄叶霉病(Fw/vz'a/w/v" (cooke)Ciferri)、 花生黄曲霉菌(J5perg/〃ws y/avws Link)、番茄枯萎病菌(Fws"n'wm ca^spcWww f. sp.)以及蓝莓烂果病一细极链格孢菌te27 a2^'a (Kunze) Wiltshire)孢子萌发和芽管的伸长的作用。本发明是以玉米为材料，M提取玉米的基因W朋和基因重组构建皿载体 质粒，并且在大肠杆菌中获得了目标基因序列表达的抗菌蛋白，该蛋白會,作为生 物杀菌剂的主要活性组分，用于生产防治植物病害的无毒、无副作用、环保的生物 农药。
本发明的技术特点 一是/A3E米中分离抗病基因；二是所分离的抗菌蛋白基因 能够通过大肠杆菌彭去；三是目标基因皿完整，抗菌活性稳定；四是该基因克隆 的方法是与基因重组技^目结合。
本发明所申请保护的抗菌蛋白基因Zl08及其编码蛋白中，经过相关软件分析 得知301个氨基酸中的保守序列主要有两个核糖核酸蛋白保守结构域(RNP— CS)、两个豆蔻酰基化位点(N-myristioylationsite)、两个蛋白激酶C (Proteinkinase C)磷酸化位点以及一个酪蛋白激酶n磷酸化位点(Caseinkinasen)、 一个N—糖 基化位点(N-glycosylation)和一个酪氨酸激酶(Tyrosine kinase),这些保守序列 直接与该蛋白的抗菌功能有关。统计分析表明，该抗菌蛋白保守序列的相关氨基酸 数量大约占该抗菌蛋白z108氨基酸总量的40%;由此推导与抗菌功能相关的核苷 酸保守序列应有30°丄因此，可以认为以该蛋白保守序列为t離合成的或分离 的植物蛋白，如果其基因结构与权利要求1戶腿的SEQ N0.1的核苷,列具有 30%以上相似序列，其蛋白结构与权利要求3戶脱的SEQN0.2的氨基 列具有 400%以上相似性，其编码蛋白必然具有用作植物杀菌剂的相同功能，即为该蛋白的 同功酶。本发明所述的SEQN0.1的核苷,列和SEQN0.2的氨基酸序列在本领 域普通技术人员使用现有技术操作下，经过一定的和部分的核苷辦列的傲布演 变、缺失、替代、剪贴、重复、倒位、易位、转座、重组和^ft妾)以及一个或数个 Dtt (氨基酸)的改变，不能够显著地影响抗菌蛋白的功能，也育^l多保持、或者降 低、或者加强对不同种植物和微生物病害的杀菌作用。{顿^1核苷 列的修饰 以及一个或数个5藤(氨基酸)改变的抗菌蛋白，并且具有与SEQNO.l的核苷酸 序列30%以上相4,列和SEQ N0.2的氨基,列40%以上相4以性、能够不显著地影响抗菌功能的此类抗菌蛋白都是本专禾啲发明内容和保护范围。
本发明的有益效果是本发明应用DNA重组技^t1分子生物学方法，从
胚芽中分离了一1^度为906bp的抗菌蛋白基因，并在大肠杆菌中表达了这段目的 基因的编码蛋白，试验结果表明这段目标基因及其编码蛋白具有抑制芽孢杆菌生 长、阻止番琉灰雾病 (Bofr3^s c/彫m3 Pers.)、辣椒根腐病菌 (i^ran'ww >so/araXMart.)App.d;woll)、番茄卩十霉病(Fw/v/a>/va(cooke)Ciferri)、番茄枯^^菌 (i^san'wm oj9^/7on'wm f. sp.)、蓝莓烂果病一细极链格孢菌(A/z^raar/a ^6"/7〃_ .5\57'鹏(Kunze) Wiltshire)以及花生黄曲霉菌C4，^z'肠yJovws Link)的 孢子萌发和芽管的伸长，具有显著抑制病原菌的作用。该蛋白能够用作生物杀菌剂 的主要活性组分，用于生产无毒、无副作用、环保的生物农药。
图l:玉米抗菌蛋白的纯化电泳
图中l为蛋白marker 2为z108抗菌蛋白的纯化3为zl08抗菌蛋白纯化 后的MlfiL酶酶切 图2: Z108抗菌蛋白与枯草芽孢杆菌共培养 图中左侧为枯草芽孢杆菌+无菌水
右上侧为枯草芽孢杆菌+酶切的z108抗菌蛋白； 右下侧为枯草芽孢杆菌+纯化z108抗菌蛋白 图3:玉米抗菌蛋白与番燕灰霉病孢子共培养
图中左侧为Zl08抗菌蛋白与番茄灰霉病 包子共培养18小时； 右侧为PDA培养液与番茄灰霉病孢子共培养18小时 图4:，抗菌蛋白与番茄叶霉病孢子共培养
图中左侧为Zl08抗菌蛋白与番茄叶霉病孢子共培养36小时；
右侧为PDA培养液与番燕叶霉病孢子共培养12小时
图5:，抗菌蛋白与花生黄霉病 包子共培养图中左侧为Zl08抗菌蛋白与花生黄霉病孢子共培养36小时；
右侧为PDA培养液与花生黄霉病孢子共培养12小时
图6:玉米抗菌蛋白与番茹枯^i孢子共培养 图中左侧为Zl08抗菌蛋白与番茄枯^)i孢子共培养36小时；
右侧为PDA培养液与番茄枯萎病病孢子共培养12小时，芽孢管长度达 至lj 87um
图7:玉米抗菌蛋白与蓝莓烂果病一细极链 菌孢子共培养
图中左侧为Zl08抗菌蛋白与细极链1^ 包菌的孢子共培养36小时； 右侧为蒸馏水与蓝莓烂果病一细极链ra菌的孢子共培养12小时;； 具鸺施力式
下面实施例^t本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。
如图1所示本发明的目标基因在原核细胞中的，抗菌蛋白得到实验的验 证，
克隆菌株pET/91-B108， 37"C过夜培养12小时以后，IPTG诱导3小时，提 取蛋白进行SDS—PAGE电泳，得到表达的蛋白，分子量约为52.1KD&应用 Promega公司的MagneHis Protein Purification System i式剂盒(V8500 )，获得纯化 彭去的抗菌蛋白。
鄉例2
如图2、 3、 4、 5、 6所示本发明的目标基因编码蛋白对病原菌的抗菌试验
图2中，抗菌蛋白基因编码蛋白的抗枯草^f包杆菌(&w7^^W"^s) 的试验经31H天的培养(37°C)枯草芽孢杆菌在不含有zl08纯化蛋白的平板上
正常生长， 分布均匀，密度较大(见图2);而混合涂抹了WM纯化蛋白的培 养基，长出得M稀少，密度较小，说明z/M纯化蛋白对枯草芽孢杆菌起到了抑
制作用，两者之间没有明显的生长差异。图3中玉米抗菌蛋白基因编码蛋白的抗番茄灰霉病(免^t"s cj'/7ez^ Pers.)的试验番茄灰霉病(AtzytJ's "'/7erea Pers.)的孢子在28。C、高湿度 条件下、PDA培养，12h以后开始萌发，18h后芽管长度达到56um。番茄灰霉病 (5o/ 7fe dw^w Pers.)的孢子在28。C 、高湿度^f牛下、纯化蛋白0.216ug/ml 共培养，直至36h后未见芽管形成，孢子没有萌发。说明WM纯化蛋白对番茄灰 霉病的孢子的萌发和芽管的伸长起到了抑制作用。
图4中玉米抗菌蛋白基因编码蛋白的抗番茄叶霉病(尸Ww'a /Wra (cooke)Ciferri)的试验番茄叶霉病的孢子在25°C、高湿度^f牛下、PDA培养， 12 h以后开始萌发，18h后芽管长度达到23um。番茄叶霉病的孢子在相同条件下、 z7朋纯化蛋白0.216ug/ml共培养，直至36h后未见芽管形成，孢子没有萌发。说 明z7朋纯化蛋白对番茄叶霉病的孢子的萌发和芽管的伸长起到了抑制作用。
图5中玉米抗菌蛋白基因编码蛋白的抗花生黄霉病"印e/^7^s /7aras Link)的试验花生黄霉病的孢子在25°C、高湿度^j牛下、PDA培养，12 h以后 开始萌发，18h后芽管长度达到27um。花生黄霉病的孢子在相同条件下、W朋纯 化蛋白0.216ug/ml共培养，直至36h后未见芽管形成，孢子没有萌发。说明W朋 纯化蛋白对花生黄霉病的孢子的萌发和芽管的伸长起到了抑制作用。
图6中玉米抗菌蛋白基因编码蛋白的抗番琉枯^ (/^sar/鹏os^，ri鹏 f. sp.)的试验番燕枯菱病的孢子在25。C、高湿度条件下、PDA培养，8h以后 开始萌发，12h后芽管长度达到87um。番茄枯萎病的孢子在相同条件下、W朋纯 化蛋白0.216ng/ml共培养，直至36h后未见芽管形成，孢子没有萌发。说明z/OS 纯化蛋白对番茄枯菱病的孢子的萌发和芽管的伸长起到了抑制作用。
图7中玉米抗菌蛋白基因编码蛋白的皿莓烂果病一细极链格孢齒 (爿Jtei77aria te"〃j'& j'鹏(Kunze) Wiltshire)的试验蓝莓'烂果病一细极^l格 孢菌的孢子与蒸馏水在25。C、高湿度剝牛下培养12小时，芽管长度达到60um以 上；zl08抗菌蛋白在相同条件下与链^f包菌的孢子共培养36小时，未见链l^菌的孢子萌发，说明W^ 纯化蛋白对蓝莓烂果病一细极链^ 包菌的孢子萌发和芽管 的伸长起到了抑制作用。
本领域的普ffiX程技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于，实施 例进行修改，添加和替换都是可能的，最终没有影响此类抗菌蛋白的杀菌功能，艮P， 其都没有超出本发明的专利内容和{跌范围。SEQN0.1含W^菌蛋白基S^斷丄m^)的克ltJi銜ET30(+)a-108的^i^^lJ
序列表SEQ NO. 1 <110〉姜国勇
<120>—种^*抗菌蛋白的基因"斷￡附-7)及其编码蛋白
<140〉专利申请号
〈141> 2007—11一24
〈170> Patent In Version 2.1
〈210〉 1
<211〉 6466
<212〉 DNA
〈213〉 pET30(+)a-D108 (￡ )//) 〈220>
〈221> misc—feature 〈222〉 (1)…(6466) <223〉 n :a或g或c或t 〈220〉
〈221〉 misc— recomb <222> (1) ... (25) 〈220>
<221> prim—bind (T7 terminator region)
<222> (26) ... (72)
〈220>
<221> misc—feature <222〉 (73) ... (139) 〈220>
〈221> prim—bind (His-tag coding region)
〈222〉 (140) ... (157)
<220>
<221> MCS (Multiple cloning site)
〈222> (158)... (314)
〈220〉
〈221〉 gene (Lm-1) <222> (315)... (1220) 〈220>
<221> MCS (Multiple cloning site)prim— bind (T7 promoter binding site) <222〉 (1221). (1361)〈220>
〈221> misc—feature
〈222〉 (1362) ... (1461).
〈220>
<221〉 prim—bind (T7promoter transcript site)
<222〉 (1462)
〈220〉
<221> Promoter (T7 promoter) 〈222> (1463)... (1479) 〈220〉 . <221〉 misc—feature <222> (1480)…(■) 〈220〉
<221〉 (Lacl ， coding region) 〈222> (1870)... (2949) <220〉
〈221〉 misc—feature 〈222〉 (2950)…(5091) 〈220〉
<221> gene(Kan resistance) <222> (5092) .. (5904) <220>
〈221〉 misc_feature 〈222〉 (5905)…(5999) <220>
〈221〉 fl origin 〈222〉 (6000) ... (6455) 〈311〉
<400〉 (1)... (6466)
ATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAA60
GGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTT120
TGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGT180
CGACGGAGCTCGAATTCGACGTTCGCGTACCCGGGTGTATTTATTTGTATACAACCGCGT24〇
ACCCGGGTGTATTTATTTGTATACAACCATAGTAATTAAGTGCAGCAGCAGATCATGATG30〇
TGTCGTTGCATTGATCAGGCCTCGTCGTCGTCGTTGTCAGCACTGGCAGCAGTAGCGGCA360
GCGGCAGTAGTTTGATTCTTAACGAGCGCAACGATCCTCGCTGCTTCGTTCTTATCCTTG420
ATGCCAAGCTTCTGCATGTCGGGGATCACAGCGGTGGGGTGCTCAGCCCACTCGAAGGCC480<formula>formula see original document page 13</formula>CAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAG2820
CTGTTGOXGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCC2880
TCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAA2940
AGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGGATC3000
TCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCAT3,
GACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCC3120
GGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGG3180
CCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTfGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCC3240
CGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCCCACGGGT3300
GCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGG3360
TTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTC3420
TGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAAC3480
GCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCT3540
ACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTT3600
TCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCG3660
GGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCAT3720
TACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAAC3780
CGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAA3840
CGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGA3900
GCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCA3%〇
GCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCA4020
GGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGA4080
TAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCAC4140
CATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAG7VTGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCT4200
CTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT4260
CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGA4320
ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGT4380
TTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGT4440
GGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGC4500
GCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAA4560
GCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCT4 620
CCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTA4680
ACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG4740
GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGC4800
CTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTA4860
CCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTG4920
GTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTT4980
TGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGG5〇4〇TCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCAT5100
ATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTA5160
TATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTG5220
TATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAAT5280
GATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACC5340
ATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGG5400
AAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCG5460
CTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGC5520
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AGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCAT5640
AAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAAC5700
CTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCA5760
GACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTA582〇
CAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTT5880
CATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATG5940
TATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGA6000
AATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATT6060
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AGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAA6180
CGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTA6240
ATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCC6300
CCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGC6360
GAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCAC6420
ACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCA6466SEQNo2繊蛋白基因z贿胖i)fiWS白ft ^^^J
MAEITLEPSD LMZVQTNKRIV PKFTE工FPVE CTDHKGIFGP VLPPEKKVPE LWLYTELKTR PGGVWWEFGK DGDTHIiGDN PRWLGFGGRY RAVNDLAKKK KMATLiEEEEV QMQMQMPEAA LjWMVCEGLR FNTVSRTVDA GFNSGHGVTL WADHPTAV工P DMQKLGIKDK NEAARIVALV
A
DANYPYSAF工ASVRKDV工KH50
TSSITLAIRMDNLYLVGFRT1〇〇
QD:L工GNKGIjENVTMGRAQMT150
DLAAAAAADPQADTKSKLVK200
TVTQGKQVQKWDR工SKAAFE250
KNQTTAAAATAASADNDDDE300
30权利要求
1、一种玉米抗菌蛋白基因z108，其特征在于所述的抗菌蛋白基因z108的核苷酸序列为SEQ N0.1所示的315-1220bp之间的906bp。
2、 一种含有抗菌蛋白基因W朋的重组质粒pET/91-108，该质粒包 含有长度为906bp抗菌蛋白基因zMS，该质粒经转化大肠杆菌获 得克隆菌株pET/91-B108，其菌种保藏号为CCTCC NO: M207179,菌种 保藏日为2007年11月14日。
3、 如权利要求1所述的抗菌蛋白基因W朋，该基因编码蛋白长度为SEQ N0.2所示的301个氨基酸，分子量为33.252KDa。
4、 如权利要求l所述的抗菌蛋白基因，其特征是编码此类抗菌蛋白的 类似基因与权利要求1所述的SEQ N0.1的核苷酸序列具有30%以上相似序 列，且编码蛋白具有用作植物杀菌剂的相同功能。
5、 如权利要求3所述的抗菌蛋白，其特征是编码具有此类同功酶的蛋 白与权利要求3所述的SEQ兩.2的氨基酸序列具有40%以上相似序列，且 具有用作植物杀菌剂的相同功能。
6、 如权利要求2所述的抗菌蛋白基因克隆菌株pET/91-B108，其特征在 于能够表达z/0S基因编码的抗菌蛋白。
7、 如权利要求6所述的抗菌蛋白基因克隆菌株pET/91-B108的应用，其 特征在于该蛋白能够作为生物杀菌剂的主要活性组分，用于生产防治植物 病害的生物农药。
全文摘要
本发明涉及植物抗病基因的分离，DNA克隆技术和基因重组技术，以及克隆菌株在植物杀菌剂等生物农药方面的应用技术领域。本发明应用DNA重组技术和分子生物学方法，从玉米胚芽中分离了一个长度为906bp的抗菌蛋白基因，并在大肠杆菌中表达了这段目的基因的编码蛋白，试验结果表明这段目标基因及其编码蛋白具有抑制芽孢杆菌生长、阻止番茄灰霉病、辣椒根腐病菌等孢子萌发和芽管的伸长，具有显著抑制病原菌的作用。该蛋白能够用作生物杀菌剂的主要活性组分，用于生产无毒、无副作用、环保的生物农药。
文档编号C12N15/29GK101475940SQ200810014139
公开日2009年7月8日 申请日期2008年2月3日 优先权日2008年2月3日
发明者姜国勇 申请人:姜国勇