专利名称：：一株乳杆菌种、含有该乳杆菌的微生态制剂的制备方法以及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株乳杆菌、含有该乳杆菌的微生态制剂以及其在动物生产中的应用，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：饲料添加剂是饲料的核心问题，自从发现词用抗生素可以通过影响肠道微生物初期在宿主体内的定植，从而起到促生长的作用之后，抗生素的应用在畜牧业方面产生了巨大的经济效益。但是由于抗生素的大量使用，随之出现的负面效应也曰益突出，表现为病原微生物产生耐药性和药物在动物产品中残留，从而对人类的健康产生潜在的危害。因此，抗生素替代品益生菌、酶制剂、酸制剂等的研究与开发成为近年来绿色词料添加剂的热点，其中益生菌备受关注。乳酸菌是微生态制剂中最重要的一类，可以促进营养的消化吸收，产生乳酸等物质抑制肠道腐败菌、致病菌的繁殖，抑制肠道感染，解除腹泻，并具有免疫活等作用。但是一般乳酸菌对干燥、高温、胃酸和胆汁等不良环境因子的抗性差，能活着进入肠道的乳酸菌种类和数量不多，目前市场上发部分产品都存在活菌数衰减的问题。作为益生菌的一种，芽孢杆菌由于具有抗逆性强、耐高温高压、易贮存等特点，其在动物生产中的作用是畜牧业的科研和生产人员所关注的焦点。但是我国饲料行业微生态制剂的生产的菌种比较落后，急需要筛选出更多种繁殖力强、性能稳定等特点的菌种以供生产应用。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种乳杆菌，该乳杆菌耐酸、耐受一定的高温，可以对大肠杆菌的生长和繁殖产生抑制作用。本发明的第二个目的是提供一种含有上述乳杆菌的微生态制剂，该制剂可有效替代抗生素作为动物饲料的添加剂，甚至其作用效果超过抗生素。本发明的第三个目的是提供一种含有上述乳杆菌微生态制剂的动物饲料，该饲料对调节畜禽肠胃微生物群落，维持肠道菌群平衡，提高生产性能等方面具有良好的促进作用。本发明的第四个目的是提供上述乳杆菌、乳杆菌微生态制剂在动物饲料方面的应用。为实现本发明的第一个目的提供一种乳杆菌，该乳杆菌为于2008年4月1日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳杆菌丄acto6,7/^^.，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.2427。所述的乳杆菌(Za"o6acz7/w;y平)CGMCCNo.2427为革兰氏阳性杆菌，在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm。细胞形态和排列呈杆状、单生，细胞内无聚-e-羟基丁酸盐(PHB)颗粒，细胞大小为0.8pmx(1.53.5^m。产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。本菌有动力，可利用葡萄糖产生乳酸。本发明提供的乳杆菌(丄actokc77/w平)CGMCCNo.2427除具有上述特征之外，还具有耐酸、耐高温等生物学特性1)该乳杆菌在pH二3的环境中，在4小时以内存活率达到90%以上。一般地，动物胃液的pH在24，这种酸性环境条件对有益菌的致死率是困扰益生菌筛选的主要问题，而本发明的乳杆菌在这种酸性条件下，存活率很高。2)该乳杆菌在95'C处理10min的时候，存活率在50%以上。幼龄动物饲料一般要经过制粒，以提高动物的生产性能，在制粒过程中，温度通常在608(TC，而大多数的微生物很难在如此高温下生存，而本发明提供乳杆菌在较高温度下能生存，具有耐高温性。大肠杆菌是导致动物发生消化道疾病的主要微生物，所以抑制大肠杆菌的生长可以控制消化道疾病的发生，本发明所述的乳杆菌aa加^d/^平)CGMCCNo.2427可以对大肠杆菌的生长和繁殖产生抑制作用，大约从培养12-15小时开始出现的抑制作用，在18小时的时候达到最大值，并且一直保持该水平直到48小时之久，这也能说明抑菌物质比较稳定，其抑菌半径在l厘米左右。本发明的第二个目的提供一种乳杆菌微生态制剂，采用上述乳杆菌在培养基中经过充分培养、发酵后得到的代谢产物与无机物混合，经烘干、粉碎后得到微生态制剂。所述的乳杆菌微生态制剂包括如下步骤制备5乳杆菌aa"o6""7/w平)CGMCCNo.2427在培养基中经过充分培养、发酵后得到的代谢产物与无机物混合，经烘干、粉碎后得到微生态制剂。所述的培养、发酵过程包括将乳杆菌接种于斜面培养基进行培养，得到的种子培养物再接种于液体培养基中培养。所述的斜面培养基为适合乳杆菌培养的任何培养基，其优选的培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g、琼脂15g以及蒸馏水1000ml。所述的液体培养基为合适乳杆菌培养的任何培养基，其优选葡萄糖营养肉汤培养基，更优选培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g以及蒸馏水1000ml。所述的培养过程为微生物培养、发酵常用的方法。其优选，所述的培养是在温度为3537'C的条件下，培养20-80小时。其优选，乳杆菌接种于斜面培养基，在温度为37'C恒温箱中培养72小时，作为种子培养物；所述的种子培养物接种于葡萄糖营养肉汤，在温度为37'C时，培养24小时。所述的乳杆菌进行培养、发酵的接种量为1%。接种量是指移入的种子的液体体积和接种后培养液体体积的比例。所述的无机物包括轻质碳酸钙或白碳黑。所述的培养、发酵后得到的代谢产物与无机物混合时的重量比为1:1-8，根据该微生态制剂在不同动物饲料中需要的含量不同，本领域技术人员可以根据需要经过有限次的试验将代谢和无机物之间的比例进行调整。本发明的动物饲料包括动物日粮与本发明的乳杆菌微生态制剂，其中乳杆菌微生态制剂的添加量为动物饲料重量的0.005%0.5%，其优选0.01%0.15%。所述的动物日粮，包括猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮或水产动物用曰粮，对于不同的动物，其日粮的配方各不相同，但是，现有技术公开的任何日粮可以作为本发明的动物饲料，其配方都是该领域的公知常识。本发明的乳杆菌、其微生态制剂作为添加剂用于制备动物饲料，其中动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等动物，其优选猪、鸡。本发明的乳杆菌a""o6a"7/w";.)CGMCCNo.2427具有耐酸、耐高温、抑制大肠杆菌生长等性能稳定的菌株，该乳杆菌微生态制剂作为动物的饲料添加剂，其可以替代现有动物日粮中的抗生素，改善消化道微生物区系、能剌激肠道内有效微6生物的增生，提供营养因子，促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物的生长、增加胸肌重量并改善饲料利用率，提高仔猪、鸡等的生产性能。本发明的乳杆菌及其微生态制剂对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，降低卵黄囊炎症引起的死亡率。本发明的乳杆菌及其微生态制剂无耐药性和药物在动物产品中残留从而对人类的健康产生潜在的危害的可能，是一种有前途的词料添加剂。保藏说明菌株乳杆菌ia"o6flc〃/iASjp.保藏日期2008年4月1日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所邮政编码100101保藏编号CGMCCNo.2427具体实施例方式下面结合实施例详细介绍本发明，所述的实施例用来理解而并非限制本发明。实施例1本实施例为保藏号为CGMCCNo.2427的乳杆菌的筛选过程，具体步骤如下(1)、出发菌种的初筛利用RogosaSL完全选择性培养基对仔猪消化道不同位置的徼生物进行选择行筛选，以获得乳杆菌。其中RogosaSL完全选择性培养基配方为现有技术，具体为胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g,蔗糖5g,醋酸钠15g，枸椽酸铵2g，磷酸二氢钾6g,七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.258，硫酸亚铁0.03g，吐温-80lg，琼脂13g，蒸馏水1000mL，用醋酸调节pH至5.0。(2)、芽孢乳杆菌的复筛利用营养肉汤培养基对初筛出的乳杆菌进行发酵，以在温度为80摄氏度,5分钟复筛；其中营养肉汤培养基配方为现有技术，具体为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g、琼脂15g以及蒸馏水1000ml。(3)、菌种的益生特性筛选利用营养肉汤培养基对耐酸性较髙的乳杆菌进行乳酸产量的筛选以及对致病性大肠杆菌抑制性能的筛选，以获得益生性能较好的乳杆菌。其中，乳酸产量筛选的标准是，在接种量为1.0%的条件下，经过20小时培养后，培养基中乳酸的含量要达到5-6%以上。对治病性大肠杆菌抑制性能的筛选的标准为乳杆菌对致病性大肠杆菌K88、K99或987P的抑菌直径要达到l.Ocm左右。经过筛选，得到一株乳杆菌Za"o^"7/^^.，2008年4月1日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo.2427。该菌菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm。细胞形态和排列呈杆状、单生，细胞内无聚-e-羟基丁酸盐(PHB)颗粒，细胞大小为0.8pmx(1.53.5)pm。产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。本菌有动力，可利用葡萄糖产生乳酸。该乳杆菌在pH-3的环境中，在4小时以内存活率达到90%以上。该乳杆菌在95'C处理10min的时候，存活率在50%以上。对大肠杆菌的生长和繁殖产生抑制作用，大约从培养12-15小时开始出现的抑制作用，在18小时的时候达到最大值，并且一直保持该水平直到48小时之久，其抑菌半径在1厘米左右。实施例2将实施例l得到的乳杆菌aa"oZwc/〃M取)保藏号CGMCCNo.2427接种于斜面培养基中，所述的斜面培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g、琼脂15g以及蒸馏水1000ml，在恒温箱中温度为37'C的温度下培养72小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于葡萄糖液体培养基中，所述的葡萄糖液体培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g以及蒸馏水1000ml，在温度为37'C条件下恒温24小时，得到的培养物与轻质碳酸钙按1:3重量比例混合，经干燥、粉碎得到乳杆菌微生态制剂。实施例3将实施例l得到的乳杆菌aa"o6acz7/ww/.)保藏号CGMCCNo.2427接种于斜面培养基中，所述的斜面培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g、琼脂15g以及蒸馏水1000ml，在恒温箱中温度为35'C的温度下培养60小时，得到种子培养物，将该种子培养物接种于葡萄糖液体培养基中，所述的葡萄糖液体培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g以及蒸馏水1000ml，在温度为36"C条件下恒温40小时，得到的培养物与白炭黑实验例1本实验例是实施例2所得到的乳杆菌微生态制剂对仔猪生产性能的影响，用72头断奶仔猪，观察日粮添加微生态制剂对仔猪生产性能的影响。仔猪按体重随机分成三个处理，即对照组、处理1以及处理2，对照组为饲喂基础日粮添加金霉素，处理1为饲喂基础日粮和添加0.01%的微生态制剂；处理2为词喂基础日粮和添加0.05%的微生态制剂。1材料与方法'1.1微生态制剂乳杆菌微生态制剂，采用实施例2的乳杆菌制剂。1.2试验动物拟选用仔猪72头，体重15.76士0.34kg，公母各半，按完全随机区组设计分为3组，每组6个重复，每个重复4头，公母分栏饲喂。1.3试验曰粮试验分为3个处理，即对照组(饲喂基础日粮+金霉素)、微生态制剂组1(饲喂基础日粮+0.01%乳杆菌制剂)和微生态制剂组2(饲喂基础日粮+0.05%乳杆菌制剂)。基础日粮的原料组成及营养成分见表1。_表l试验日粮组成成分_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注1预混料组成每千克日粮含有:vitaminA，5，512IU;vitaminD3，2,200IU;vitaminE，6.1IU;vitaminB，12，276ug;riboflavin,5.5mg;D-pantothenicacid，13.8mg;niacin,30.3mg;cholinechloride,551mg;Mn，lOOmg;Fe，励mg;Ze,画mg;Cu，234mg;I，1.4mg;Se，0.3mg;Co,l.Omg2微生态制剂混入预混料中，对照组添加金霉素lOOppm3实测值1.4饲养管理试验于北京太平猪场进行，饲养28天，猪只自由采食和饮水。舍内温度为18°C，湿度55%。每圈有单独的食槽和饮水器。1.5实验室分析词料的常规分析按照AOAC(1990)所提供的方法进行分析测定。氨基酸用氨基酸自动分析仪进行测定。1.6数据统计分析试验数据根据Duncan's多重比较用SPSS6.0(美国SPSS公司)软件进行分析处理。2结果表2为在日粮中添加乳杆菌微生态制剂对仔猪生产性能的影响结果。表2微生态制剂对仔猪生产性能的影响对照组处理1处理2SEMPDay0-7平均日增重(kg)0.460.530.430.0503NS平均日采食量(kg)1.020.931.040.0929NS饲料转化率2.291.812.430.1973NSDay8-14平均日增重(kg)0.740.750.710.0329NS平均日采食量(kg)1.201.171.190.0213NS饲料转化率FCR1.621.041.680.4311NSDay15-21平均日增重(kg)0.770.880.770.0896NS平均日采食量(kg)1.661.601.600.0670NS饲料转化率2.152.042.090.1304NSDay22-28:平均日增重(kg)0.820.890.830,0367NS平均日采食量I(kg)1.841.791.790.0568NS饲料转化率2,282.012.160.1946NSDay0-28平均日增重(kg)0.670.740.69O扁lNS平均日采食量(kg)1.361.321.380.0466NS饲料转化率2.041.912.060.0661NS由表2可以看出，对照组，加入微生态制剂处理1组和微生态制剂处理2组的平均日增重分别为0.67，0.74禾H0.69kg;平均日采食量为1.36，1.32禾卩1.38kg;饲料转化率为2.04，1.91和2.06。全期微生态制剂组1的日增重较对照组提高了10%，可以有效替代抗生素，甚至其作用效果超过了抗生素，即日粮中添加适当微生态制剂，可以提高仔猪的生产性能。实验例2本实验例为实施例2乳杆菌微生态制剂对肉鸡的生产性能的影响，选用360只体重相近的1日龄健康艾维茵肉(AA)雏鸡(公雏)，随机分成5个处理，每个处理8个重复，每个重复9只鸡。采用单因子随机区组试验设计，各组分别在基础曰粮中以微生态制剂0、1、3、6和10g/kg加入微生态制剂。试验分两个阶段，即0~3周和46周。1材料与方法1.1试验动物与饲养管理选用出生体重相近的1日龄健康AA肉雏鸡(公雏)360只，打上翅号后随机分成5组，每组72只。参照NRC(1994)肉鸡营养需要，以玉米-豆粕型日粮为基础日粮，分03周龄，46周龄两阶段饲养。试验基础日粮组成及营养水平见表3。试验鸡采用阶梯笼养，每笼3只。第一周用红外灯取暖，室温控制在3234'C，以后每周降低23。C。03周每日光照24h，46周每日光照20h。第7d和14d分别滴鼻、点眼进行传支和新城疫弱毒苗及法氏囊的免疫，21d和28d分别饮水免疫传支和新城疫弱毒苗二联苗及传染性法氏囊。饲料以粉料形式饲喂，试验鸡自由采食和饮水。1.2试验设计本试验采用单因子随机区组试验设计，试验分为5个处理，即基础日粮(微生态制剂水平为0，添加黄霉素8ppm)、1、3、6和10g/kg微生态制剂，每个处理8个重复，每个重复9只鸡。1.3样品的采集11每天记录动物死亡数，同时称重、结料。分别于第21d和42d以重复为单位称鸡只重量，结料，计算饲料消耗和动物增重。1.4样品分析日粮常规养分的分析测定按照AOAC(1995)方法进行。饲料和饲料原料中氨基酸含量使用氨基酸自动分析仪(HitachiL-8800,日本)进行测定，大多数氨基酸的测定使用6mol/LHCl酸水解方法，含硫氨基酸(蛋氨酸和胱氨酸)用氧化水解程序进行前处理(GB/T15399-94)，色氨酸使用碱水解(4mol/LLiOH)后在高效液相色谱上测定(ShimadzuLC10，曰本)。脂肪酸的测定参照Sukhija和Palmquist(1988)方法在气相色谱仪(HP6890，美国)上以C19:0作为内标进行定量。总能的测定使用氧弹测热仪(Parrl281，美国)。表3试验基础日粮组成及营养水平(％)组成0~3周4~6周玉米56.5259.15豆粕31.0030.26豆油4.004.82鱼粉5.002.00石粉1.191.57磷酸氢钙0.830.77食盐0.260.31DL-蛋氨酸0.190.06赖氨酸0.010.06预混料11.001.00合计100.00100.00营养水平粗蛋白质221.2418.86代谢能ME,Kcal/g3.053.10钙20.870.92有效磷0.450.35赖氨酸21.120.98蛋氨酸+胱氨酸20.880.64t预混料为每千克全价料提供维生素A,9000IU;维生素D3，1850IU;维生素E，18IU;维生素K，2.0mg;维生素B。1.0mg;核黄素，7.0mg;泛酸，15.0mg;维生素B6，3,0mg;维生素Bu，0.01mg;烟酸，36.0mg;氯化胆碱，300mg;叶酸，0.60mg;生物素，0.10mg;锰，80.0mg;铁，75.0mg;锌，60.0mg;铜，4.0mg;碘，0.4mg禾口硒，0.3mg。2实测值1.5数据统计用SPSS9.0统计软件对各项数据进行方差分析和多重比较。2结果与讨论2.1微生态制剂对肉鸡生产性能的影响实施例2微生态制剂对肉鸡平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和饲料采食量与增重比(F/G)等的影响见表4。表4微生态制剂对肉鸡生产性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>同列数据肩标不同者表示差异显著(PO.05)'平均标准误从表4实验数据显示得出，在0~3周，日粮中添加6g/kg微生态制剂组的ADG高于其它组，而3g/kg微生态制剂组的ADG最低，并且两组差异显著(户O.05);各试验组饲料转化效率的变化情况与ADG的变化相同，即6g/kg微生态制剂组F/G最低，3g/kg微生态制剂组F/G最高，两组差异显著(P<0.05)。在46周，F/G随着微生态制剂添加量增加而降低，6g/kg和10g/kg微生态制剂组的F/G显著低于对照组(P<0.05)。在0~6周，添加6g/kg和10g/kg微生态制剂组的F/G显著低于对照组(尸O.Ol)。从上述实验可知，本发明提供的乳杆菌微生态制剂作为饲料添加剂，通过调节动物的消化道菌群平衡和免疫机能，可以有效替代抗生素。在日粮中添加乳杆菌微生态制剂可以改善试验末期和全期肉鸡的饲料转化效率，6g/kg和10g/kg微生态制剂的改善效果明显，饲料转化效率较对照组提高3.8%。微生态制剂对一些水产动物的促生长作用已得到大多数相关研究的证实。大多数研究认为，微生态制剂可以促进肉仔鸡生长、增加胸肌重量并改善饲料利用率，降低卵黄囊炎症引起的死亡率(Lignell等，1998;Inborr，1998)。对本发明的实验例3得到的乳杆菌微生态制剂也分别进行了如同实验例1的实验，结果相似。本发明人将实施例2的乳杆菌微生态制剂添加到水产动物、反刍动物的日粮中进行实验，实验结果显示，同样可以替代抗生素作为饲料添加剂。权利要求1、一种乳杆菌，其特征在于，该乳杆菌为于2008年4月1日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳杆菌Lactobacillussp.，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.2427。2、根据权利要求1所述的乳杆菌，其特征在于，所述的乳杆菌的生物学特性如下1)在pl^3的环境中，在4小时以内存活率达到90%以上；2)在温度为95'C处理10分钟，存活率在50%以上。3、一种含有权利要求1或2所述乳杆菌的乳杆菌微生态制剂，其特征在于，乳杆菌在培养基中经过充分培养、发酵后得到的代谢产物与无机物混合，经烘干、粉碎后得到微生态制剂。4、根据权利要求3所述的乳杆菌微生态制剂，其特征在于，所述的培养、发酵过程包括将乳杆菌接种于斜面培养基进行培养，得到的种子培养物再接种于液体培养基中培养。5、根据权利要求3或4所述的乳杆菌微生态制剂，其特征在于，所述的斜面培养基为适合乳杆菌培养的任何培养基；其优选的培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g、琼脂15g以及蒸馏水1000ml。6、根据权利要求3或4所述的乳杆菌微生态制剂，其特征在于，所述的液体培养基为合适乳杆菌培养的任何培养基；其优选葡萄糖营养肉汤培养基；更优选培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、葡萄糖2.5g以及蒸馏水1000ml。7、根据权利要求3-6任一项所述的乳杆菌微生态制剂，其特征在于，所述的培养是在温度为3537。C的条件下，培养20-80小时；其优选乳杆菌接种于斜面培养基，在温度为37'C恒温箱中，培养72小时，作为种子培养物，所述的种子培养物接种于液体培养基，在温度为3537'C时，培养24小时,所述的液体培养基为葡萄糖营养肉汤。8、一种含有权利要求3-7任一项所述乳杆菌微生态制剂的动物饲料，包括动物日粮和乳杆菌微生态制剂，所述的乳杆菌微生态制剂在动物饲料中的添加量为动物饲料重量的0.005%0.5%，其优选0.01%0.15%。9、根据权利要求8所述的动物饲料，其特征在于，所述的动物日粮包括猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮或水产动物用日粮。10、权利要求1或2所述乳杆菌或权利要求3-7任一项所述的乳杆菌微生态制剂在动物饲料上的应用。全文摘要本发明提供了一种乳杆菌、乳杆菌微生态制剂其制备方法、含有该微生态制剂的饲料及其用途，所述的乳杆菌为于2008年4月1日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的乳杆菌Lactobacillussp.，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.2427，是一种具有耐酸、耐高温、抑制大肠杆菌生长等性能稳定的菌种，该菌种在培养基中经过充分培养、发酵后得到的代谢产物与无机物混合，经烘干、粉碎后得到微生态制剂，该乳杆菌及其制剂主要作为动物饲料添加剂，调节动物的消化道菌群平衡和免疫机能，可有效替代抗生素作为动物饲料的添加剂，甚至其作用效果超过抗生素。文档编号C12N1/20GK101475919SQ200810239549公开日2009年7月8日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者潘宝海申请人:北京巨润农业科技发展有限公司