专利名称：一种环氧化物水解酶基因、载体、工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环氧化物水解酶(印oxide hydrolase，EH)基因及其重组表达载体、基 因工程菌，及其在制备重组环氧化物水解酶中的应用。
背景技术：
EH是一类广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物以及微生物体内的水解酶，能选择性水 解外消旋环氧化物生成具有光活性的环氧化物和二醇。微生物来源的EH不对称拆分外消 旋的环氧化物，具有底物谱和酶的来源广泛，对映体选择性高，不需要金属离子和辅酶，菌 体可以通过发酵大量得到，在非水介质中也能保持较高催化活性等特点。近年来，人们已在多种微生物中发现了环氧化物水解酶，如Rhodococcus equi, Rhodococcus ruber, Nocardia, Mycoplana rubra, Bacillus megaterium, Diplodia gossipina, Streptomyces strains, Rhodotorula glutinis, Bacillus subtilis, Sphingomonas echinoides, Rhodotorula araucariae, Rhodosporidium toruloides, Agrobacterium radiobacter, Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus niger 等。其 中，部分环氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主中表达(大肠杆菌、毕赤酵母、耶 氏酵母等)，获得产酶活力提高的基因工程菌，随后用于不对称拆分外消旋环氧化物，在手 性环氧氯丙烷的制备中也有应用。手性环氧氯丙烷是一种重要的有机合成中间体，在医药、化工、农药等领域应用广 泛。化学法拆分外消旋环氧氯丙烷需要使用重金属，会造成环境的污染。生物法拆分具有 反应条件温和、环境友好的优点，但是具有高效拆分外消旋环氧氯丙烷活性的微生物报道 较少，因此，通过基因工程技术获得能选择性水解外消旋的环氧氯丙烷的EH基因，构建高 表达的基因工程菌有着重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种环氧化物水解酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及 其在制备重组环氧化物水解酶中的应用。本发明采用的技术方案是
一种环氧化物水解酶基因，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列
1GGTCTCCTCG AGAAMGAGCMCCCATACCTTTGCTAGTCCTCCMCMGATTCACAGTA
61GATATCCCTC MTCCGMTTAGATGAGCTGCATTCTCGACTAGATMGACMGATGGCCA
121GCMCCGAGA TAGTTCCAGAGGATGGMCC GATGACCCTACGGCATTCGGCTTGGGGGCT
181GGACCMCCT TGCCACTTATGAMGAGTTA GCTMGGGATGGAGAGMTTCGATTGGMG
241AMGCTCMG ATCACTTGMCACCTTTGMCACTACATGGTCGAMTCGAGGATCTATCT
301ATACACTTTT TGCACCATAGGTCTACCAGA CCTMTGCTGTCCCTCTMTACTATGTCAT
361GGTTGGCCTG GTCACTTTGGAGAGTTCTTG MTGTGATTCCATTGTTGACTGAGCCMGT
421GACCCATCCG CTCMGCTTTTCACGTGGTG GCTCCATCMTGCCTGGATATGCTTGGAGT
3
481TTACCCCCACCATCCTCTMGTGGMCATGCCCGACACCGCCAGAGTGTTCGATMGCTT
541ATGACGGGACTTGGTTATGAGAMTATATGGCTCMGGTGGTGATTGGGGATCTATTGCA
601GCTCGTTGCCTTGGTTCATTGCATMGGACCACTGTMGGCTGTGCACCTAMCTTTCTG
661CCAGTGTTCCCACCAGTCCCCATGTGGCTAATAMTCCACATACTCTACTGGCATGGGCT
721CCMGATTTCTTGTTCCCGAAAMCAGGCTGCTCGTATGAAGAGAGGACTTGCCTACTTG
781GAGAMGGATCTGCATACTACGTCATGCAGCMTTGACTCCACGTACCCCTGCCTATGGA
841CTTACAGATTCTCCAGTTGGACTACTAGCATGGATTGGTGAAAMTTCGAGCCCACCATC
901CAGGAGGCTTCTAMCAGGCCCMCCMCGTTGACGCGTGATGMTTGTACTTTACTTGT
961TCCTTATACTGGTTCACACGTTCTATTGGTACTTCTTTTCTGCCCTACAGTTTGMCCCA
1021CATTTTACTACATTCCTGACCGATTCCAMTACCATTTACCAMCTTTGCCCTMGTCTT
1081TATCCCGGAGAGATTTATTGCCCAGCCGMAGGGACGCTAAGAGGACAGGCMTTTGMG
1141TGGATCMGGACGCTCCAGAAGGAGGACACTTCGCTGCCCTTGAAMGCCAGACGTCTTT
1201GTTGAGCATCTTAGAGMGCCTTCGGTGTTATGTGGGAMMCATCATCATCATCACCAT
1261TGA 该环氧化物水解酶基因来源于微生物Rhodosporidium toruloides (中国普通微 生物菌种保藏管理中心(北京)，编号为AS. 2. 1389)该序列全长为1263bp，其碱基组成 为
权利要求
一种环氧化物水解酶基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的环氧化物水解酶基因，其特征在于所述环氧化物水解酶基因编 码SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种含有权利要求1所述环氧化物水解酶基因的重组载体。
4.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.如权利要求1所述的环氧化物水解酶基因在制备重组环氧化物水解酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为构建含有所述环氧化物水解 酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导 培养，培养液分离得到含有重组环氧化物水解酶的菌体细胞。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组环氧化物水解酶作为转化用酶，以 外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应制备R-环氧氯丙烷。
全文摘要
本发明提供了环氧化物水解酶(EH)基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组环氧化物水解酶中的应用。本发明提供了一种环氧化物水解酶核苷酸序列；构建了一种含有该基因的表达重组质粒pET-28b-EH，将其转化至大肠杆菌BL21中，获得了含有表达质粒pET-28b-EH的重组大肠杆菌BL21/pET-28b-EH，并利用该菌株表达生产重组环氧化物水解酶；提供了一种以本发明构建的重组大肠杆菌为酶源进行生物催化与转化的方法，生产R-环氧氯丙烷，为手性环氧氯丙烷的工业化生产提供可能。
文档编号C12N15/55GK101967489SQ20101022621
公开日2011年2月9日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者壮晓健, 张莉萍, 柳志强, 沈寅初, 胡忠策, 郑裕国 申请人:浙江工业大学