专利名称：分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体的制备。具体而言，本发明公开了 2个单链抗体，这些抗体是人肌酸激酶的分子伴侣。本发明还涉及人肌酸激酶的分子伴侣的制备过程。本发明的单链抗体具有促进肌酸激酶正确折叠的作用，本发明的抗体可以用于人肌酸激酶药物的生产过程中，在制药领域具有一定的应用价值。
背景技术：
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于动物的肌肉、心脏以及脑等组织的胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量转移、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要 M Bl [Kuby S, Noltman E.Creatine kinase. The Enzymes,1962,6 :515-6030. Alan C, Mcluaghin. The interaction of 8-Anilino-l-naphthalen-esulfonate with creatine kinase. The Journal of Biological Chemistry, 1974,249(5) : 1445-1452.]，它可逆地催化肌酸与ATP-Mg2+之间的转磷酰基反应。肌酸激酶属于磷酸原激酶大家族中的一员，存在于ATP快速再生的细胞中，在离子跨膜运输、细胞吞噬作用、糖酵解调控、脑突触神经传递的释放中起着重要作用[Theo ffallinann, Malus ffyss, Dieter Brdicaka Intracellular comparemention. structure and function of creatine kinase isoenzymes in tissues with high and fluctuating energy demands :the phosphocreatine circuit' for cellular energy homeostasis. Biochem J,1992,281(1) :21-40.]。
肌酸激酶的同功酶在临床诊断中有十分重要的意义[Seraydrarian M W and Abbot B C. The role of the creatine phosphokinase system in muscle. J. Mol. Cell. Cardiol. 1976,8 :741-746. Yukio Ishiguro, Kanefusa Kato MD. The diagnostic and prognostic value of pretreatment serum creatine kinase BB levelsin patients with neuroblastoma. Cancer 1990,65 :2014-2019.Kouttinen A. Purification of human and canine creatine kinase isozymes. Acta Med. Scand. Suppl. 1978,623 :115-117.]。 在多种病变，如肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人血清中肌酸激酶水平迅速提高，因此它常用作临床诊断的指示剂。正常人血清中并没有MiMi-CK，如其在血清中出现，可能是肿瘤组织泄露所致，应高度怀疑患有恶性肿瘤。所以在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶活性是做心电图诊断的重要补充。肌酸激酶因为其具有重要的生理功能和临床应用价值，已经引起人们广泛关注和研究。近年来，研究发现肌酸激酶与阿尔兹海默症(AD)也有着千丝万缕的联系，在AD病人体内BB-CK由于受氧化作用的影响，大量失活。研究人员发现在基因改造的 AD小鼠脑部发现肌酸的沉积，同样在AD病人的海马中也有此现象。肌酸激酶在能量代谢方面发挥重要作用，肌酸激酶的失活使AD病情恶化。进而作者猜想在某个时间点，以肌酸激酶为靶点，也许能够阻止或者推迟神经退行性疾病[Tanja S. B urklen, Uwe Schlattner, Ramin Homayouni et al. The Creatine Kinase/Creatine Connection to Alzheimer' s disease :CK Inactivation, APP-CK Complexes, and Focal Creatine Deposits. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2006,1-11]。
2001年，Lin等解析出了分辨率为3. 5 A的人肌肌酸激酶晶体结构[Yue-quan Shen, Liang Tang, Zheng-j iong Lin, et al. Structure of human muscle creatine kinase. Acta Crystallographica Section D，2001，57 :1196-1200.]。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基(约为43kDa)组成的二聚体。分子内有8个半胱氨酸(Cystein)残基，其中两个半胱氨酸残基位于分子表面。目前认为处于283位置的半胱氨酸在酶活性中十分重要[Mohana Rao J K,Grzegorz Buj acz,Alexander fflodawer. Crystal structure of rabbit muscle creatine kinase. FEBS Letters, 1998,439(1) :133-137.]。肌酸激酶有还原型(没有二硫键)和氧化型两种类型(存在一对链内二硫键)，其中还原型肌酸激酶约占85%左右。噬菌体抗体库是依赖噬菌体展示技术发展起来的，它将抗体分子Fab或scFv等片段与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，展示于噬菌体颗粒表面，它既能识别相应抗原与其相结合，又能够感染宿主菌进行再扩增。经过“吸附-洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体[Hoogenboom HR, De Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology, 1998,4 :1-20. Lu J, Sloan SR. An alternating selection strategy for cloning phage display antibodies. Immunol Methods, 1999,228(1-2) :109-119.]。噬菌体抗体库技术既可制备抗体又可改良抗体特性， 如进行体外亲和力成熟，获得高亲和力的特异性抗体。抗体库技术解决了人单抗制备的难题，可通过两种途径，一是免疫抗体库，抗体基因来自于经抗原免疫过的供体；另一个是构建大容量抗体库。分子伴侣最早由 Laskey [Laskey RA, Honda BM,Mills AD et al. Nucleosomes are assembled by an acidic proteinwhich binds histories and transfers them to DNA. Nature,1978,275(5679) :416-420. Flynn GC,Pohl J,Flocco MT，et. al. P印tide-binding specificity of the moIecularchaperone BiP. Nature,1991,353 (6346) :726-730.] 在1987年提出，他将细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装的核质素 (nucleoplasmin)称为分子伴侣。在体内，分子伴侣可能依次在蛋白质折叠中发挥作用，通过ATP水解推动着一系列蛋白质的折叠，最终释放出折叠好的天然状态的蛋白质 [Thirumalai D and Lorimer GH. Chaperonin-mediated protein folding. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2001, 30 :245-269.]。按照 Ellis 的定义，分子伴侣是一大类可以进行分组的但各不相关的蛋白质，这些蛋白质在体内都具有帮助含有蛋白质的结构进行非共价的组装或者分拆的功能特征[Ellis RJ and Hemmingsen SM. Molecular chaperones proteins essential for the biogenesis of some macromolecular structures. Tends Biochem Sci, 1989,14(8) :339-342.]。现在已经发现了许多种蛋白质具有分子伴侣活性， 如GroEL、热休克蛋白(Heat Shock Protein, HSP)等。分子伴侣可以根据分子的大小、功能或分布进行分类。最常用的分类方式是根据相对分子质量进行分类，主要包括以下几种 1)HSP8家族(包括泛素等)；2)GroES和相应的HSPlO家族；3)小分子伴侣(Small Heat Shock Protein, sHSP,包括 HSP25、HSP27、HSP32 等)；4)DnaJ 和 HSP40 ；5)Hsp47 和胶原伴侣蛋白(collagenin) ；6)肽链脯氨酸(顺反)异构酶(the peptidil-prolil-cis-Tra ns-iso-merases, PPI_s) ；7)蛋白质■^硫键异构Sl (the protein-disulfid-isomerases, PDI-S) ；8)61~(^1^和把 60家族；9)参与形成折叠体的DnaK和HSP70家族；10) Clp家族(TheClp-families)、HSP90及其同源体以及HSPlOO和HSP 110家族。其中肽链脯氨酸(顺反) 异构酶和蛋白质二硫键异构酶还具有酶的功能，与其他分子伴侣蛋白有一定的不同，是一类特殊作用方式的分子伴侣。研究表明，分子伴侣在很大范围内能在动力学上帮助蛋白质折叠，一般通过与非天然蛋白质构象暴露的疏水表面结合，阻止蛋白质聚沉，并促进蛋白质正确折叠 [Bucciantini MiGiannoni EiChiti F，et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature，2002，416(6880) 507-511.]。而这一过程，实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的过程。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌I^eudomonas cepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。而一般的分子伴侣识别特异性不高，具有一定的普适性。分子伴侣依靠识别蛋白的非天然构象来实现其功能。在天然蛋白质分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能会暴露出来。新生肽段在折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面。分子伴侣可以识别非天然构象中的疏水表面，并与之结合。例如，合成的蛋白质在缺失Hsp60的突变体中不能正确折叠为天然态，并成为不可溶的。同样，在体外，Rubisco蛋白及乳糖脱氢酶的亚基变性后，在稀释复性中大量聚沉，不能复活。Hsp70和Hsp40能识别和结合非天然蛋白质的疏水侧链[Bukau B，Horwich AL. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell，1998，92 :351-366.]。在热激或其它压力下，20kD的小热激蛋白(sHsp)能与变性蛋白质结合成寡聚体防止聚沉。HSP90可识别新生的多肽、错误折叠或变性蛋白质暴露的疏水端，协助其折叠或再折叠，防止其与细胞内其他蛋白质发生不可逆的聚集，对于无法复性的蛋白质，则转到蛋白质降解系统将其降解。 Bip是内质网管腔内的分子伴侣，通过检测Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(ff/X)-Hy-X-Hy-X-Hy motif 与 Bip 结合最强，Hy 最多的是 Trp、Leu、Phe,即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。分子伴侣具有可用于治疗折叠病，帮助包涵体蛋白复性等实用价值。目前基于分子伴侣的研究，都是针对于热激活蛋白、GroEL等传统分子伴侣。这些分子伴侣对靶蛋白的选择性不高，可以与多种蛋白质结合，帮助其正确折叠。当使用这类分子伴侣作为折叠病的治疗手段时，会遭遇到疗效不高、副作用大等问题。最近研究得较多的是一类被称为 “化学分子伴侣”的小分子物质，这类小分子物质(例如作为酶的竞争性抑制剂而设计的小分子药物)具有较强的专一性，它们进入细胞内后，可以专一性地与目标蛋白质结合，帮助其折叠成适当的构象，使其顺利通过细胞内的质控系统并转运到细胞内的特定部位，在目标部位，在酶底物的竞争作用或其他生理因素作用下(如溶酶体内的酸性环境)，“化学分子伴侣”可以与折叠好的蛋白质脱离，使该蛋白能够执行其正常生理功能[Cohen FE and Kelly JW. Therapeutic approaches to protein misfolding diseases. Nature,2003, 426 905 909.]。借鉴于“化学分子伴侣”的设计思路，我们提出了一个新的设想，即设计或筛选可以与目标蛋白质专一性结合的大分子型分子伴侣，抑制错误折叠与聚沉的产生，帮助目标蛋白质正确折叠。这类大分子型的分子伴侣相比于小分子的“化学分子伴侣”，具有毒副作用小、专一性更强、在体内容易清除等优点。所以我们利用大容量的scFv(单链抗体)噬菌体抗体库，以人肌肌酸激酶为抗原，从中筛选其单链抗体，继而分析其在折叠方面的作用，探索具有分子伴侣功能的抗体，为开发新药物提供一条新途径。
发明内容
本发明制备了分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV。本发明公开了所述的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV的氨基酸序列。CKSCFV有2种 CKSCFV 1和CKSCFV2，其中CKSCFV1氨基酸序列为SEQ ID NO :1，CKSCFV2氨基酸序列为SEQ ID NO :2。本发明公开了所述的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV的表达载体与基因序列，其中 CKSCFV 1的基因序列为SEQ ID NO :3，CKSCFV2的基因序列为SEQ ID NO :4。本发明同时一种宿主细胞，包含上述内容所述的载体。本发明对分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV进行了研究，所述的 CKSCFV可以与人肌酸激酶相互作用并能促进人肌酸激酶的正确折叠，并且展示了良好的效^ ο本发明所述的单链抗体CKSCFV，可以应用于人肌酸激酶药物添加物的生产过程中。
图1已纯化的人肌酸激酶结果图。经分析，肌酸激酶纯度可以达到95%以上。图2单链抗体CKSCFV1的12% SDS-PAGE电泳鉴定图。M为蛋白分子量标准；1为集菌后培养液上清；2为硫酸铵沉淀样品；3为透析除盐后用于亲和层析的样品；4为未与 HisTrap柱结合的样品；5为洗脱下来的样品；6为最终纯化后样品。图3CKSCFV2的电泳与免疫鉴定。左图单链抗体CKSCFV2的15% SDS-PAGE电泳图。1为集菌后培养液上清；2为硫酸铵沉淀样品；3为透析除盐后用于亲和层析的样品；4为未与HisTrap柱结合的样品；5 为洗脱下来的样品；6为最终纯化后样品；M为蛋白分子量标准。右图Western Blotting 检测CKSCFV2与CK的结合。HCK经SDS-PAGE后转硝酸纤维素膜，用纯化的CKSCFV2孵育， 然后用CKSCFV2所带的标签抗体进行Wfestern Blotting检测。图4单链抗体CKSCFV1对天然肌酸激酶活性的影响。曲线分别代表不同CKSCFV1 浓度下，CK活性的变化，括号中的标志在图中表示真实数据点。CK与CKSCFV1的浓度比分别为 1 0(·)、1 0·5(Δ)、1 1(令)、1 2(口)。图5单链抗体CKSCFV1对胍变性肌酸激酶复性率的影响。曲线分别代表不同 CKSCFV1浓度下，CK再折叠过程中活性变化，括号中的标志在图中表示真实数据点。CK与 CKSCFV1 的浓度比分别为 1 0(·)、1 0. 5(Δ)、1 0. 75 ( ▼ ) U 1(令)、1 2(口)。图6单链抗体CKSCFV1对胍变性肌酸激酶复性过程聚沉情况的影响。曲线1_4分别对应肌酸激酶在含不同浓度CKSCFV1的缓冲液中复性的聚沉曲线，CK与CKSCFV1的浓度比分别为 1 O(I)U 0. 5(2),1 0. 75(3) U 1(4) 图7单链抗体CKSCFV2对天然肌酸激酶活性的影响。曲线分别代表不同CKSCFV2 浓度下，CK活性的变化，括号中的标志在图中表示真实数据点。CK与CKSCFV2的浓度比分别为 1 0(·)、1 0·5(Δ)、1 1(令)、1 2(口)。
图8单链抗体CKSCFV2对胍变性肌酸激酶复性率的影响。曲线分别代表不同 CKSCFV2浓度下，CK再折叠过程中活性变化，括号中的标志在图中表示真实数据点。CK 与 CKSCFV2 的浓度比分别为 1 0(·)、1 0.25( )」0. 5 ( ▼ ) U 0. 75 ( □)、1 1(〇)。
图9单链抗体CKSCFV2对胍变性肌酸激酶复性过程聚沉情况的影响。曲线1_4分别对应肌酸激酶在含不同浓度CKSCFV2的缓冲液中复性的聚沉曲线，CK与CKSCFV2的浓度比分别为 1 0(1) U 0. 25(2) U 0. 5(3) U 0. 75(4)、1 1(5)。
图10在不同浓度的单链抗体CKSCFV2中CK再折叠IOmin后的内源荧光光谱的变化。曲线1代表完全变性CK的内源荧光光谱，2代表天然CK的内源荧光光谱，3-7分别代表不同CKSCFV2浓度下，再折叠CK内源荧光光谱的变化。CK与CKSCFV2的浓度比分别为 1 0(3),1 0. 25(4),1 0. 5(5),1 1(6),1 2(7)。在图中右上角给出了每条曲线对应的最大发射峰位值λΜΧ。
图11CKSCFV2抗体与HCK的肽段相结合后经^festern Blotting鉴定结果。
具体实施方式
1.实验材料
重组HMCK质粒Pet_21b的宿主菌E. coli BL21为北京师范大学生物化学系保存；大肠杆菌菌株XLI-Blue、无琥珀抑制子的大肠杆菌菌株HB2151、VCSM13和大容量噬菌体抗体库为海军总医院中心实验科保存；限制性内切酶为TaKaRa公司产品；卵清蛋白 (OA)和铁蛋白Per)购自Sigma公司；各种酶标抗体购自Promega公司和Sigma公司； 抗原管(Immunotube)购自丹麦NUNC公司；β -巯基乙醇、盐酸胍(Gdn-HCl)和SDS来自 Merck ；ΑΤΡ、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均为Fluka产品；kpharose Fast Flow、CL-6B凝胶、HisTrap系GE产品；MOPS，IPTG，AMP、Gly为Amresco产品；其他试剂为国产分析纯。
2.实验方法
1)抗原-人肌酸激酶的纯化
①重组菌的培养与IPTG诱导
分别挑取少量重组有HMCK基因的质粒pET_21b转化菌株E. coli BL21菌种，接种于含Amp(终浓度50yg/ml)的:3ml LB液体培养基上，于37°C培养过夜。以的接种量将摇好的接种于含Amp (终浓度50 μ g/ml)的400ml TM液体培养基中，恒温培养池后(0D600 约为0. 5)，加入诱导剂IPTG终浓度为0. 4mM, 18°C继续培养21h。4°C，6000rpm离心20min, 弃上清液，菌体沉淀置于-20°C保存待用。
②蛋白质的纯化
将菌体用30ml 缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, PH8. 0，IOmM β -巯基乙醇)溶解菌体。功率为400W下超声破碎，工作时间3S，间隔5S，超声时间共20min。18000rpm离心 25min。留上清用于上样。柱装好后，用0. Olmol/L PH8. 5Tris_HCl缓冲液平衡层析柱，过夜，直至流出液的PH与上柱缓冲液完全相同。控制流速，使平衡至少5倍柱体积。将离心后上清上柱，流速0. 5mL/min。上柱完毕后，用0. 01mol/L PH8. 5Tris_HCl缓冲液I洗柱，洗至基线。流速为lml/min。
将梯度洗脱器和层析柱连接好。在洗脱瓶A (混合器)和洗脱瓶B (贮存器)内各装入100毫升缓冲液I和缓冲液II，观察两洗脱瓶，使两液面应处于同一水平面，同时应该排除连接管内气泡。启动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度。以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。将两瓶和柱上下连接管道打开，用部分收集器开始收集洗脱流出液。控制洗脱流速为lml/min，收集比活力较高的样品。用0. 05mol/L碳酸盐Buffer (pH9. 6)对收集样品进行透析和超滤浓缩，用快速相液相色谱法(Amersham pharmacia ΑΚΤΑ纯化仪，使用凝胶过滤柱Superdex TM 75HR 10/30column)进行分离，收集HMCK的单洗脱峰。SDS-PAGE电泳鉴定分离效果。③蛋白浓度及酶活力测定将SDS-PAGE鉴定得到的目的蛋白收集合并，测定总体积。浓缩后的样品需要用考马斯亮蓝G250测定蛋白浓度，并精确测定酶活性。肌酸激酶活力测定在双光束紫外分光光度计(GBC)上通过pH-比色法测定，在 597nm波长下监测吸光度的变化。测活溶液现用现配。配制方法为取5ml48mM肌酸，力口入0.5ml 0. lmol/L的乙酸镁，Iml 0. 1 % (质量分数)的百里酚蓝(Thymol Blue)，0.5ml 0. lmol/L pH值为9.0的Gly-NaOH缓冲液，称ATP溶于此溶液，再补加水:3ml，用 0. 1-0. 2mol/L NaOH调此溶液在597nm下吸光度为1. 6-1. 8即可。2)噬菌体抗体的筛选将CK用0. 05mol/L碳酸盐Buffer (pH9. 6)稀释至100mg/L，以ImL包被免疫管， 4°C过夜。用30g/L脱脂奶粉封闭1小时，用含0. 05% Tween-20的PBS洗涤两遍，将液体空尽，加入ImL噬菌体抗体库(约3X IO13个cfu)，37°C孵育2小时，以含0. 05% Tween-20的 PBS洗涤。我们采用两种方法回收结合于固相的噬菌体抗体。方法一加入ImL新鲜培养的XLl-Blue菌，(预培养至0D600 = 0. 4)直接感染，37°C孵育15min，转入9mL SB培养液中。方法二 将细菌感染回收后的免疫管中加入ImL洗脱液(0. IM HCL,0. 1% BSA，用Gly 调至PH2. 2)，洗去残留在壁上的噬菌体，37°C静置15min，之后再用2M Tris中和至中性，约加40yL(具体要测定)。再加入2mL XLl-Blue细胞37°C孵育15min，将其转入到7mL的 SB培养液中。从两次回收的菌液分别取出适量铺氨苄青霉素培养盘(100 μ g/mL AMP)测定滴度 (CFU)，其余菌液37°C培养3小时，扩大体积到100ml，加入2ml辅助噬菌体VCSMl3，30°C振荡培养过夜。4°C，15min，IOOOOrpm离心回收上清。将回收的上清，加入到4g PEG8000,3g NaCl固体中，摇勻，使PEG与NaCl溶解，待固体溶解后，将三角瓶置于冰上，冰浴40min。冰浴后，将液体离心10000rpm，25min。留沉淀。用37°C预热的1 % BSA重悬，离心除杂。然后将其加入到第二支包被好CK的免疫试管中，37°C孵育，2小时。进入第二轮淘洗。总共进行四轮淘洗。每轮筛选后均需测定次级库的滴度，并计算噬菌体抗体的投入产出比(回收率)，作为特异性噬菌体抗体富集的指标。3)噬菌体抗体的鉴定①ELISA实验鉴定噬菌体抗体从筛选第三轮，第四轮的培养盘随机挑取集落在含有100 μ g/mL Amp的SB培养液中过夜，第二天取30 μ L细菌到ImL SB (含100 μ g/mL Amp)培养液中，37°C培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30°C培养过夜，离心收取上清即得到噬菌体抗体。将抗原稀释
8至50 μ g/mL,以50 μ L包被ELISA板，37°C孵育2小时，弃去孔内液体，用30g/L脱脂奶粉封闭1小时，加入噬菌体抗体，37°C孵育2小时，用含0. 05% Tween-20的PBS洗涤三遍，将液体空尽，加入HRP-抗M13鼠mAb进行反应，洗涤3遍后，加入OPD底物显色，酶标仪读取 A490 值。②可变区基因的多样性分析(DNA指纹及测序鉴定)挑选ELISA结果好的样品，以对应菌液为模板，进行PCR反应，扩增抗体基因。按照表2-2加样进行PCR反应。94°C预变性，然后94°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸lmin， 反应30个循环，然后72°C 7min,最后4°C保温。PCR产物用CL-6B凝胶微型柱离心纯化， 再用限制性内切酶MvaI (10 μ L中力卩1 μ L) 37°C消化2小时，每10 μ LPCR产物中加入1 μ L 酶。取10 μ L进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。EB染色后通过比较带型推测其是否为相同的基因。将不同的结果留下来，取样，测序，做进一步鉴定。MvaI酶切位点如下CC ▼ (A/T) GGGG (Τ/Α) ▲ CC4)可溶性单链抗体的制备将预先摇至对数生长期的ΗΒ2151菌加入到小指管内，每支lmL，向小指管内加入 20μ L已经得到鉴定的表达不同种抗体的噬菌体，轻轻混勻，放置15min，LB平板(AMP)划线，过夜。从LB平板上挑取单菌落，接种于ImLSB培养基中，30°C，250rpm摇菌3小时。补加含有IPTG的SB培养基，使IPTG终浓度为ImM，摇菌过夜。6000rpm离心lOmin，使菌体沉淀，上清中就含有可溶性单链抗体。用于ELISA检测。方法与检测噬菌体抗体相同。其中包括包被CK的孔板，包被OA(卵清蛋白)孔板，包被!^er (铁蛋白)孔板。后面两孔板为对照组，检测非特异性结合。每个孔板中用PBST作为阴性对照。所用二抗为anti-V5-HRP antibody (Invitrogen)。OPD显色，读取A490。收集阳性结果。将获取的阳性结果对应的菌株保种，待用。5)可溶性蛋白的表达与纯化①重组菌的培养与IPTG诱导分别挑取少量含有表达单链抗体质粒的HB2151菌株，接种于含Amp (终浓度 100yg/ml)的:3ml SB液体培养基中，37°C培养过夜。以1 %的接种量将上述培养物接种于含Amp (终浓度100 μ g/ml)的400ml SB液体培养基中，37°C培养至0D600 = 0. 6-0. 8，加入 IPTG (终浓度ImM)，30°C继续培养16h。4°C下6000rpm离心20min，收集上清液。②硫酸铵沉淀浓缩目的蛋白在上清液中缓慢加入硫酸铵，至硫酸铵饱和度为40%，充分搅拌，静置lh，待沉淀完全后，于4°C 8000r/min离心20min，保留沉淀。用少量PBS缓冲液将沉淀重悬，在4°C下用同样缓冲液透析过夜，除去残留的硫酸铵。③HisTrap亲和层析柱纯化scFv单链抗体将HisTrap柱与恒流泵、紫外检测仪连接好，用Binding buffer (20mM磷酸盐， 500mM NaCl，20mM咪唑)平衡柱子5-10倍体积。将透析好的样品在4°C下12000rpm离心IOmin除去杂质，0. 5ml/min上样。上样完毕后，用Binding buffer清洗，直到紫外吸收值降到基线稳定不变。用分别含50mM，IOOmM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM咪唑的Elution buffer (20mM磷酸盐，500mM NaCl)依次洗涤lml。根据紫外检测仪指示收集样品。
④凝胶过滤纯化单链抗体并除咪唑与更换缓冲液
含有scFv的样品浓缩后，用凝胶过滤柱Superdex TM 75HR 10/30 column进行分子筛层析操作，用IOmM Tris-HCl(pH8. 0)缓冲液洗脱，收集scFv的单洗脱峰。用截留量为 IOKD的超滤管进行样品浓缩，3000g离心，使样品体积达到适当的大小，回收样品。
⑤单链抗体的检测
SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果。电泳结束后，蛋白转移至PVDF膜(300mA，1小时)。 5%脱脂奶粉室温封闭1小时，用纯化好的svFv抗体4°C孵育过夜，TBST洗膜三次，每次10 分钟；V5抗体4°C孵育过夜，TBST洗膜三次，每次10分钟；碱性磷酸酶标记二抗室温孵育1 小时；TBST洗膜三次，每次10分钟；加入碱性磷酸酶显色底物显色。
6)肌酸激酶的单链抗体scFv对肌酸激酶再折叠的影响作用
①活力检测
利用pH比色法测定肌酸激酶的活力，方法同上。首先将肌酸激酶用3M盐酸胍溶解变性1小时，然后用含有不同浓度的肌酸激酶单链抗体scFv的IOmMTris-HCl，2mM DTT 缓冲液(PH8. 0)稀释30倍(肌酸激酶终浓度为2.2μΜ)，在一定时间间隔取样测活，监测 597nm光吸收的变化。所有检测在25°C下进行。
②浊度检测
首先将肌酸激酶用3M盐酸胍溶解变性1小时，然后用含有不同浓度的肌酸激酶单链抗体scFv的IOmM Tris-HCl, 2mM DTT缓冲液(pH8. 0)稀释30倍(肌酸激酶终浓度为 2. 2 μ M)，立即检测在400nm光吸收值的变化，持续检测15分钟。所有检测在25°C下进行。
③内源荧光的检测
首先将肌酸激酶用3M盐酸胍溶解变性1小时，然后用含有不同浓度的肌酸激酶单链抗体scFv的IOmM Tris-HCl, 2mM DTT缓冲液(pH8. 0)稀释30倍(肌酸激酶终浓度为 2. 2 μ M)，复性10分钟后，检测样品的内源荧光光谱。激发波长为^5nm，发射光谱的扫描范围从305nm到400nm。所有检测在25°C下进行。
7)蛋白质印迹分析抗体结合位点
将人肌肌酸激酶的氨基酸序列按照每12个氨基酸为一组，每组向后错位1个氨基酸依次合成，固定于一张纤维素膜上。完成一个周期后，从头开始，每组向后错位2个氨基酸，依次合成，固定于同一张膜上。将带有固定肽段的膜(简称为“肽膜”)用纯化好的scFv 单链抗体孵育，然后上下覆盖经甲醇和转膜缓冲液处理过的同等大小的PVDF膜，夹心法转膜，恒流0. 8mA/cm2,电转移3小时，经过一抗、二抗孵育，加入碱性磷酸酶显色底物显色，用蒸馏水漂洗终止显色。将PVDF膜上显色的点对应肽段的氨基酸序列，找出肌酸激酶上可能的结合位点，参照PDB数据库中人肌肌酸激酶的晶体结构进行分析，分析工具为protein workshop 和 3D-SURFER。
3.实验结果
1)人肌酸激酶的纯化
菌体破碎后上清经过离子交换层析与分子筛层析，经SDS-PAGE检测为单一条带， 纯度在95%以上，可以用来筛选scFv抗体和进行各项功能检测(图1)。
2) ELISA初步筛选阳性结果与指纹图谱分析
我们从筛选第三轮与第四轮的培养盘随机挑取克隆培养过夜，然后加入辅助噬菌体扩增噬菌体，得到噬菌体抗体，用于进行ELISA初步检测。研究显示，有56个孔为阳性结果，在图中显示为深色的孔，需继续鉴定。考虑到这56个样品中某些样品可能具备相同的抗体基因，所以我们首先做DNA指纹图谱分析，进而将收集到得样品分类。将ELISA检测的阳性结果对应克隆挑出，进行PCR反应，扩增对应的抗体基因。PCR 的产物经纯化后，用限制性内切酶Mva I酶切，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。56个样品全部进行检测，观察发现具备六种不同图谱。鉴定得到的六种图谱对应六种不同的抗体基因。 将六种样品取样测序，通过比对，最终确定得到六种不同基因的噬菌体抗体。将鉴定出六种不同的噬菌体抗体，将这6个scFV抗体分别命名为CKSCFV1、 CKSCFV2、CKSCFV3、CKSCFV4、CKSCFV5 与 CKSCFV6。进行 ELISA 试验，检测是否特异性结合。 从表1中可以看出六种噬菌体抗体与CK有很好的结合，与其他三种蛋白无结合。证明六种噬菌体抗体皆有与CK特异性结合的能力。表1噬菌体抗体的ELISA检测
权利要求
1.分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV，所述的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV 为CKSCFV1和CKSCFV2，其中CKSCFV1氨基酸序列为SEQ ID NO :1，CKSCFV2氨基酸序列为 SEQ ID NO :2。
2.一种载体，包含分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV的基因序列，为SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4 之一。
3.一种宿主细胞，包含权利要求2所述的载体。
4.根据权利要求1所述的分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV，其特征在于， 所述的CKSCFV可以与人肌酸激酶相互作用并能促进人肌酸激酶的正确折叠。
5.根据权利要求1所述的单链抗体CKSCFV，其特征在于，可以应用于人肌酸激酶药物的生产过程中。
全文摘要
本发明公开了分子伴侣功能的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV，包括2种氨基酸序列。本发明也提供了所述抗体的基因序列、载体以及宿主细胞。本发明详细的描述了本发明的具体操作过程。本发明所述的人肌酸激酶单链抗体CKSCFV，可以与人肌酸激酶相互作用并能促进人肌酸激酶的正确折叠，并且展示了良好的效果。CKSCFV具有很好的应用前景，可以应用于人肌酸激酶药物添加物的生产过程中。
文档编号C12N1/21GK102477096SQ201010556989
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者李森 申请人:北京师范大学