专利名称：一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体是一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表 达β-淀粉酶的方法。
背景技术：
β-淀粉酶(EC3.2.1.2)又称淀粉1，4_麦芽糖苷酶，作用于淀粉和糖原时可切断 非还原性末端的α-1，4糖苷键，分解得到麦芽糖。淀粉酶主要用于代替部分麦芽生产 啤酒，或用于生产啤酒发酵用淀粉糖浆，以及用于生产高麦芽糖浆、超高麦芽糖浆、结晶麦 芽糖、医用针剂麦芽糖、麦芽糖醇等。淀粉酶可从植物和微生物中制取获得。目前商品化的淀粉酶主要是从植 物中制取。植物来源的淀粉酶多从一些高等植物如大麦、小麦、黑麦、大豆的种子和甘 薯的块茎中提取。从大麦中提取淀粉酶的主要缺点是需要耗费大量的粮食，因此通过 微生物发酵生产淀粉酶是另一种较好的选择。一种微生物发酵生产淀粉酶的方法 是利用本身能够分泌β-淀粉酶的细菌如芽孢杆菌属的Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus cereus等发酵产生β -淀粉酶，并通过物理、化学诱变提高菌株产酶 活力和酶的热稳定性，通过优化菌种的发酵条件来提高酶产量。然而这种方法随机性大，不 容易获得既高产又能产酶学性质优异的淀粉酶的菌株。另一种微生物发酵生产淀 粉酶的方法则是通过基因工程的方法将不同来源的β-淀粉酶克隆到表达宿主构建重组 菌进行生产。王银定等从诺卡氏菌Nocarida sp.中选育高产菌株，周蓓芸、王峥等和高温放 线菌Thermoactinomyces sp.中选育高产菌株，并克隆到大肠杆菌中表达β -淀粉酶，得到 最适温度60°C，产酶活力1000U/ml的结果。但大肠杆菌表达系统存在一些缺陷，如含有内 毒素、肠毒素、难以分泌表达，产物需要破胞提取等，而且为了保持质粒的稳定性，在生产过 程中一般需要使用抗生素。为了避免重组微生物发酵过程中残留的抗生素类物质对于食品 安全的影响，国际上对微生物来源的酶制剂的抗菌活性有严格限制，JECFA(Joint FA0/WH0 Expert Committee on Food Additives，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂 联合专家委员会)和AOAC (Association of Analytical Communities，美国官方分析化学 师协会)等国际组织将抗菌活性列为食品用酶制剂的重要检验要求，这对酶制剂生产企业 提出了更高的要求。枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏 蛋白质，是一种食品安全的菌种。另外，枯草芽孢杆菌表达系统还具有以下优点1具有很 强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地处理发酵上清液即 可得到较纯的目标蛋白质；2没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函 体；3发酵条件简单；因此，开发利用枯草芽孢杆菌表达系统生产食品添加剂具有深远的意 义和广阔和市场前景。根据所采用载体类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为可复制质 粒表达和染色体整合表达。染色体整合表达是使用枯草芽孢杆菌整合质粒，将外源基因整
3合到枯草芽孢杆菌染色体中，外源基因随染色体的复制而复制和表达，这样外源基因在宿 主中可保持较好的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β -淀粉 酶的方法。利用整合质粒将淀粉酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构 建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到β -淀粉酶。本发明解决上述技术问题的技术方案如下1. 一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β -淀粉酶的方法，该方法的 步骤为将淀粉酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿 主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢 杆菌，用重组枯草芽孢杆菌在液体营养培养基中表达β-淀粉酶。上述的淀粉酶表达元件，包含如下组分能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基 因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和β -淀粉酶 基因。能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，可以是来源于枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子。能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断，可以是来源于高温产 硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因信号肽DNA 片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌果 聚糖蔗糖酶基因McB信号肽DNA片断。β-淀粉酶基因，可以是来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因，或来源于大麦(Hordeum vulgare)的β-淀粉酶基因。枯草芽孢杆菌整合质粒能够将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中。美国俄亥 俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC，http://WWW. bgsc. org)收藏了大量的枯草芽孢 杆菌整合质粒。这些质粒大部分可以用于本发明。其中一个优选特例是整合质粒PMLK83。 该质粒有两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在这两段同源臂中有 新霉素抗性基因。质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过新霉素抗性选择，只有整合到枯草芽孢 杆菌染色体中的重组菌才能生长，从而筛选出重组子。方法中所述的宿主枯草芽孢杆菌，最常用的是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如 1A751, WB600，或 WB800。2. 一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产淀粉酶的方法，是以整合型重 组枯草芽孢杆菌为菌种在营养培养基中发酵生产β-淀粉酶。所述的营养培养基是常规的发酵生产方法采用的营养培养基，例如包含1 50g/ L胰化蛋白胨，1 50g/L酵母提取物，5 20g/L NaCl的液体培养基，或相同蛋白质含量的 水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液体培养基。发酵生产方法，是常规的发酵生产方法，包括接种、培养、分离、浓缩和包装等步马聚ο本发明首次将β -淀粉酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌 种，常规的生产工艺，发酵生产淀粉酶。本发明的优点是本发明利用食品安全的表达系统生产淀粉酶，整合型表达 的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本 发明要求保护范围的限制。实施例1本实例将包含来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43启动 子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的a_乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来 源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因 单顺反子的β -淀粉酶表达元件克隆到整合质粒PMLK83，然后转化宿主菌WB600构建整合 型重组枯草芽孢杆菌，最终在LB液体培养基中发酵生产β -淀粉酶。1.构建重组质粒pMLK83-P43根据Genbank中注释的启动子Ρ43序列，设计上游引物为 5‘attgctggacgcttatggac 3，和下游弓|物为 5，cgggatccattcctctcttacctataat 3，。PCR 反 应体系 IOOul :DNA模板(枯草芽孢杆菌 1A751 总 DNA) Iul (约 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各为 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚 合酶 Iul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反应程序94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin ;4°C保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III 分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5 α中，经筛选鉴定获得重组 质粒 pMLK83-P43。2.构建重组质粒 pMLK83-P43-CTBA以全基因合成的方式合成如下DNA片断1GGATCCATGAΑΑΑΑΑΑΑΤΑΤCATCACTTCTATCACATCTCTGGCTCTGGT
51TGCCGGGCTGTCTTTGACTGCTTTTGCAGCTACAACGGCTAGCATAGCAC
101CAAATTTCAAAGTTTTTGTAATGGGTCCATTAGAAAAAGTCACAGATTTT
151AATGCATTCAAAGATCAATTGATAACTTTAAAGAATAATGGTGTTTATGG
201TATAACAACAGATATTTGGTGGGGCTATGTTGAAAATGCAGGTGAAAATC
251AATTTGACTGGAGTTATTATAAGACATATGCTGATACCGTACGCGCTGCG
301GGATTGAAGTGGGTTCCAATAATGTCAACGCATGCCTGTGGAGGTAATGT
351TGGTGATACAGTAAATATACCTATTCCGTCATGGGTATGGACAAAAGATA
401CCCAAGATAATATGCAGTATAAGGATGAAGCCGGAAATTGGGATAATGAA
451GCAGTAAGTCCATGGTATTCTGGCTTAACCCAACTCTATAATGAATTTTA
501TTCATCTTTTGCATCAAATTTTAGCAGCTATAAAGATATAATTACTAAAA
551TATATATATCTGGAGGCCCTTCTGGAGAATTAAGATATCCTTCATATAAT 601 CCTTCGCATG GATGGACATA TCCTGGACGT GGCTCGCTGC AGTGCTATAG
651TAAAGCGGCTATAACAAGTTTTCAAAATGCTATGAAGTCTAAATATGGAA
701CTATAGCAGCAGTTAATAGTGCATGGGGTACAAGCCTAACTGATTTTTCT
751CAAATTAGTCCACCTACAGATGGTGATAATTTCTTTACAAATGGTTATAA
801AACTACTTATGGTAATGACTTTTTGACATGGTATCAAAGTGTTTTGACTA
851ATGAGTTAGCCAATATTGCTTCTGTAGCTCATAGCTGCTTTGATCCAGTA
901TTTAATGTTCCAATAGGAGCAAAAATAGCTGGAGTGCATTGGCTATATAA
951TAGTCCGACAATGCCACATGCTGCAGAATATTGTGCCGGTΤΑΤΤΑΤΑΑΤΤ
1001ATAGCACGCTACTCGATCAATTTAAGGCATCTAATCTTGCTATGACATTT
1051ACATGTCTTGAAATGGATGATTCTAATGCATATGTAAGTCCATATTATTC
1101TGCACCTATGACGTTAGTCCATTATGTAGCTAATCTTGCTAATAATAAAG
1151GTATAGTCCACAATGGAGAAAATGCTTTGGCTATATCCAACAACAATCAA
1201GCTTATGTGAATTGTGCAAATGAATTAACAGGATATAATTTTTCTGGATT
1251TACACTTTTAAGACTTTCGAATATTGTAAATAGTGATGGATCTGTGACAT
1301CAGAGATGGCTCCTTTTGTAATTAATATAGTTACACTAACGCCTAACGGT
1351ACGATACCAGTTACATTTACAATAAACAATGCGACAACTTATTATGGACA
1401AAATGTATATATTGTTGGTAGTACATCTGATCTTGGAAATTGGAATACAA
1451CCTATGCCCGTGGTCCTGCATCATGCCCTAATTATCCTACTTGGACAATA
1501ACGCTTAATCTATTACCTGGTGAGCAGATACAGTTTAAAGCTGTAAAAAT
1551TGATAGTTCAGGAAATGTAACTTGGGAAGGTGGCTCGAATCATACTTATA
1601CTGTGCCGACATCTGGGACTGGTAGTGTCACCATTACATGGCAAAATTAA
1651TCAATAAAATGTTACACATAGAACAAATTGTAAACACTGGAATATATTCC
1701GGTGTTTTTTTGTATATTATGGGCGTTTAATCCGCGG将合成的DNA片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Me II进行双 酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组 质粒 pMLK83-P43-CTBA。3.整合型质粒pMLK83-P43-CTBA在枯草芽孢杆菌中的转化取一满环枯草芽孢杆菌WB600甘油保藏菌种划LB平板，37°C培养箱培养过夜。转 化前一天晚间挑单菌落至:3ml LB培养基中，37°C，250rpm培养过夜，第二天上午取160 μ 1 培养液转接至8ml SPI培养基中(SPI培养基SP盐加体积浓度为50% (W/V)葡萄糖 溶液和 (V/V)体积 100 X CAYE 溶液；SP 盐溶液含 1. 96g/L (NH2) 2S04，13. 72g/L K2HPO4, 5. 88g/L KH2PO4,0. 196g/L MgS047H20 (单独灭菌)和 0. 98g/L 柠檬酸钠；100 X CAYE 溶液 含20g/L酪蛋白氨基酸和100g/L酵母抽提物。)，37°C，250rpm培养至对数生长末期(约 4 5小时)；取0. 2ml生长至对数末期的培养液至aiil SPII培养基中(SPII培养基SPI 培养基加入 1 %体积 50mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积 250mmol/L MgCl2 溶液)，37°C，IOOrpm 培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入20ul 10mmol/L EGTA，再于37°C，IOOrpm培 养10分钟；将上述处理后的菌液分装成0. 5ml每管，加入5ul质粒pMLK83-P43_CTBA (50ng/ ul)，再于37°C，250rpm培养90分钟，取菌液涂布新霉素(20ug/ml) LB平板。用PCR方法筛 选α-淀粉酶缺失的转化子即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB600[CTBA]。筛选α-淀 粉酶缺失转化子的PCR方法如下
合成如下弓I 物:aaml :5，ggtctgatcgatgggatgtc 3，；aam2 5‘ tcatcatcgctcatccatgt3' ；w2p 5‘ actgacgattaccttgcg 3‘ ；baci-pl 5’ cttccaatcacccgctctt 3’ .将转化子在LB培养基中过夜培养后，提取总DNA.然后分别 用引物对aaml/aam2和w2p/baci_pl进行PCR. PCR反应条件分别如下aaml/aam2 :PCR 反应体系 20ul :DNA 模板(转化子总 DNA) Iul (约 20ng)，10 X Taq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各为 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反应程序94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存；w2p/baci-pl :PCR反应体系 20ul :DNA模板(转化子总 DNA) Iul (约 20ng)，IOXTaq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各为 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反应程序-M°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 70s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存；如果某一转化子用W2pAaCi-pl引物对做PCR得到大约1. Ikb的产物，而用aaml/ aam2引物对做PCR得不到大约450bp的产物，则这个转化子是α -淀粉酶缺失的转化子。4. β -淀粉酶的生产，操作步骤如下1) 一级种的制备从含新霉素20ug/ml的LB平板(LB培养基蛋白胨10g/L，酵 母膏5g/L，NaCllg/L，平板加15g/LAgar)上接WB600[CTBA]单菌落在LB液体培养基 37°C、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种。2) 二级种的制备一级种接种于800ml LB液体培养基，于37°C，220rpm培养至 0D600为0. 6左右(约4 5小时)。3)三级种的制备将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37°C，以柠檬酸、NaOH 控PH 7. 0左右，通风搅拌，溶氧控制在20 30 %，培养至0D600为0. 6左右(约5 6小 时)。4)生产罐发酵将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36 38°C，通风搅 拌，溶氧控制在20 30%，以柠檬酸、NaOH控pH 6 8，培养约沈小时，IOOOOg离心力离 心除菌，用截留分子量5000 10000超滤膜浓缩上清液后，即得β -淀粉酶浓缩原液。β -淀粉酶酶活的测定按如下方法进行吸取9ml 10g/L淀粉溶液于 700C 士0. 5°C恒温水浴预热5min后，加入1. Oml β -淀粉酶粗酶液混勻，置于70°C 士0. 5°C 恒温水浴准确反应30min，置于冰水浴aiiin终止反应，混勻，吸取1. Oml溶液至IOml具塞试 管，加入1. 0ml DNS试剂(甲液称取6. 9g结晶酚溶于15. 2ml 100g/L的NaOH溶液，用蒸 馏水稀释至69ml，再加入6. 9g亚硫酸氢钠。乙液称取255g酒石酸钾钠溶于300ml IOOg/ L的NaOH溶液，再加入880ml 10g/L的3，5- 二硝基水杨酸溶液。甲液和乙液混合得黄色试 剂贮于棕色瓶内，室温下避光放置7天后作标准曲线)，置沸水浴中加热5min，流动水冷却 至室温，用蒸馏水稀释至IOml，混勻，以空白对照调零，用分光光度计在540nm波长下进行 比色，记录吸光度。空白对照由灭活后的样品溶液代替样品溶液。酶活定义为1ml酶液在 70°C、pH6. 0条件下，1小时水解10g/L淀粉液生成Img麦芽糖，即为1个酶活力单位，以U/ ml表不。经测定，发酵原液离心后，上清液的酶活为6000U/ml左右。实施例2
本实例将包含来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基 因amyM的启动子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α -乙酰乳酸脱羧酶基因信号 肽DNA片断和来源于大麦(Hordeum vulgare)的β -淀粉酶基因的单顺反子的β _淀粉酶 表达元件克隆到整合质粒PMLK83，然后转化宿主菌WB600构建整合型重组枯草芽孢杆菌， 最终在LB液体培养基中发酵生产β -淀粉酶。1.构建重组质粒 pMLK83_amyM根据Genbank中注释的启动子amyM序列，设计上游引物为 5，cccaagcttctgtacacttgcgtcctcca 3，和下游弓I物为 5，cgggatcctctcctcccctttcaatgtg 3，。PCR 反应体系 IOOul :DNA 模板(Baclicus licheniformis ATCC 14580 总 DNA) Iul (约 20ng) ,5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各为 2ul， 2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 Iul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反应程序-MV 5min ； 940C 30s, 600C 30s, 72°C 30s，30 个循环；72°C IOmin ；4°C保存。PCR 片段和质粒 pMLK83 用 限制性内切酶BamH I.Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌 DH5 α中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83_amyM。2.构建重组质粒 pMLK83-amyM_BBA以全基因合成的方式合成如下DNA片断1 GGATCCATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT51 TGCCGGGCTG TCTTTGACTG CTTTTGCAGC TACAACGGCT GTGAAAGGCA101ACTATGTCCAAGTCTACGTCATGCTCCCTCTGGACGCCGTGAGCGTGAAC
151AACAGGTTCGAGAAGGGCGACGAGCTGAGGGCGCAATTGAGGAAGCTGGT
201AGAGGCCGGTGTGGATGGTGTCATGGTAGACGTCTGGTGGGGCTTGGTGG
251AGGGCAAGGGCCCCAAGGCGTATGACTGGTCCGCCTACAAGCAGTTGTTT
301GAGCTGGTGCAGAAGGCTGGGCTGAAGCTACAGGCCATCATGTCGTTCCA
351CCAGTGTGGTGGCAACGTCGGCGACGCCGTCAACATCCCAATCCCACAGT
401GGGTGCGGGACGTCGGCACGCGTGATCCCGACATTTTCTACACCGACGGT
451CACGGGACTAGGAACATTGAGTACCTCACTCTTGGAGTTGATAACCAGCC
501TCTCTTCCATGGAAGATCTGCCGTCCAGATGTATGCCGATTACATGACAA
551GCTTCAGGGAGAACATGAAAGACTTCTTGGATGCTGGTGTTATCGTCGAC
601ATTGAAGTGGGACTTGGCCCAGCTGGAGAGATGAGGTACCCATCATATCC
651TCAGAGCCACGGATGGTCGTTCCCAGGCATCGGAGAATTCATCTGCTATG
701ATAAATACCTACAAGCAGACTTCAAAGCAGCAGCAGCGGCGGTCGGCCAT
751CCTGAGTGGGAATTTCCTAACGATGCCGGACAGTACAATGACACTCCCGA
801GAGAACTCAATTCTTCAGGGACAACGGGACATACCTAAGTGAGAAGGGGA
851GGTTTTTCCTTGCATGGTACTCCAACAATCTGATCAAGCACGGTGACAGG
901ATCTTGGATGAAGCAAACAAGGTCTTCTTGGGATACAAGGTGCAATTGGC
951AATCAAGATCTCTGGCATTCACTGGTGGTACAAGGTTCCAAGCCATGCAG
1001CCGAGCTCACAGCTGGGTACTATAACTTACATGATAGAGACGGCTACAGA
1051ACCATAGCACGCATGCTCAAAAGGCACCGTGCTAGCATTAACTTCACTTG
1101CGCGGAGATGAGGGATTCGGAGCAAAGCTCGCAGGCGATGAGCGCACCAG
1151AAGAACTAGTCCAACAGGTGTTGAGTGCTGGATGGAGAGAGGGCCTAAAT
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1251CATACTCAGGAATGCGAGGCCTCATGGAATCAACCAGAGCGGCCCTCCTG
1301AGCACAAGCTGTTTGGATTCACCTACCTTCGGCTGTCGAATCAGCTGGTG
1351GAGGGACAAAACTATGTCAACTTCAAGACCTTTGTCGACAGAATGCATGC
1401CAACCTGCCTCGTGACCCATATGTTGATCCAATGGCGCCTTTGCCAAGAT
1451CAGGGCCAGAAATATCGATTGAGATGATCCTACAAGCAGCACAGCCAAAA
1501CTGCAGCCATTCCCCTTCCAGGAGCACACCGACCTGCCAGTAGGCCCTAC
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1601AAGTTAAAGGCCCTACTGGTGGCATGGGTGGGCAGGCTGAAGACCCTACT
1651AGTGGCATGGGTGGGGAGCTCCCTGCCACCATGTAATCAATAAAATGTTA
1701CACATAGAACAAATTGTAAACACTGGAATATATTCCGGTGTTTTTTTGTA
1751TATTATGGGCGTTTAATCCGCGG
将合成的DNA片段和质粒PMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Sac
酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组 质粒 pMLK83-amyM-BBA.
株进行
左右ο
3.整合型质粒pMLK83-amyM-BBA在枯草芽孢杆菌中的转化以及用获得的重组菌 β-淀粉酶的生产同实施例1。此菌株发酵原液离心后，上清液的酶活为4500U/ml
权利要求
1.一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法，其特征在于， 该方法的步骤为将β-淀粉酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质 粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组 枯草芽孢杆菌，用重组枯草芽孢杆菌在液体营养培养基中表达β -淀粉酶。
2.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达淀粉酶 的方法，其特征在于，所述的淀粉酶表达元件包含如下组分能够在枯草芽孢杆菌中 高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和 β-淀粉酶基因。
3.根据权利要求2所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶 的方法，其特征在于，所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子。
4.根据权利要求2所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的 方法，其特征在于，所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来 源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β -淀粉酶基因 信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草 芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因McB信号肽DNA片断。
5.根据权利要求2所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀 粉酶的方法，其特征在于，所述的淀粉酶基因为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆 菌(Clostridium thermosulfurogenes)的 β -淀粉酶基因，或来源于大麦(Hordeum vulgare)的β-淀粉酶基因。
6.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达淀粉酶的 方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒PMLK83及其衍生质粒。
7.根据权利要求1所述一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达淀粉酶 的方法，其特征在于，所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如1Α751， WB600，或 WB800。
8.—种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产淀粉酶的方法，其特征在于，以整 合型重组枯草芽孢杆菌为菌种在营养培养基中发酵生产β-淀粉酶；所述的营养培养基是常规的发酵生产方法所采用的营养培养基；所述的发酵生产方法，是常规的发酵生产方法，包括接种、培养、分离和浓缩。
全文摘要
本发明公开了一种在枯草芽孢杆菌中以整合型的方式重组表达β-淀粉酶的方法。具体是将β-淀粉酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产β-淀粉酶。本发明的优点是本发明利用食品安全的表达系统表达生产β-淀粉酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
文档编号C12R1/125GK102127529SQ20101056364
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者周礼芹, 廖东庆, 张云光, 李晓明, 梁莲华, 蒙健宗 申请人:南宁邦尔克生物技术有限责任公司