专利名称：家蚕Bmlp3基因启动子及其运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及家蚕aiilp3基因启动子及其运用。
背景技术：
家蚕是重要的经济昆虫，曾为中华民族文化经济社会发展做出了极为重要的贡献。同时，其遗传背景清楚，遗传资源丰富，又是国际公认的鳞翅目模式昆虫。家蚕的重要性状之一就是末龄幼虫脂肪体具有高效合成蛋白质的能力，在五龄后期至化蛹这段时间内， 蚕的脂肪体非常发达，约占体重的30%，基于这一特点，将其开发成新型生物反应器，可以利用转基因蚕生产更多种类的有用蛋白，拓宽家蚕的应用领域，提高家蚕的应用价值，推动我国蚕学与昆虫学科的长远发展。自基于piggBac转座子为介导的家蚕转基因技术获得成功以来，这项技术已经运用于家蚕基因功能的研究以及将转基因家蚕作为“生物工厂”的探索，例如Ras基因功能的研究，丝心和丝胶蛋白基因启动子的鉴定等等，这些都为本研究的工作开展打下了良好的 ■石出。30K蛋白是家蚕末龄幼虫血液中的主要蛋白，1ρ3基因是其家族中成员之一，它的以下特征促使将其调控元件作为开发脂肪体生物反应器的启动子①脂肪体特异表达所有的30K蛋白基因都是在脂肪体中合成后分泌到血液中，脂肪体是其转录合成的场所；② 强大的转录效率目前鉴定的30K家族成员已达到10个之多，它们的表达水平差异很大， 1ρ3是其中表达量最高的基因之一；③时期表达相对集中1ρ3基因从五龄中后期到蛹期这段时间内转录合成，与脂肪体蛋白质含量最高的时期相吻合。这些特征为利用家蚕&iilp3 基因启动子在脂肪体表达外源蛋白提供了理论支持，而且在利用PiggBac来源的转座子介导的家蚕转基因的研究报道中，有关利用家蚕30K蛋白基因启动子在脂肪体表达外源蛋白的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基因启动子，该启动子以家蚕的基因组为模板， 通过设计的1ρ3启动子上下游引物来扩增得到的。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述家蚕&iilp3基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 上述序列的获得步骤为以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板进行PCR扩增，上游弓I物为5' -ggaattccagtatagttacaacggctgcccc-3'，下游弓丨物为5' -cgggatcccgcgtc gagtcctgcaatatgt-3'，扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒， 72 °C延伸80秒，共30个循环；最后72 °C延伸10 min,4 °C保存。本发明的目的之二在于提供家蚕aiilp3基因启动子的运用，该运用为开发家蚕脂肪体外源蛋白表达的生物反应器提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的家蚕anlp3基因启动子在脂肪体中表达外源蛋白的运用。进一步，所述家蚕aiilp3基因启动子在脂肪体中表达红色荧光蛋白的运用。本发明的目的之三在于提供一种重组载体，所述重组载体注射到家蚕早期胚胎后可导致脂肪体表达外源蛋白。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述的家蚕anlp3基因启动子的重组载体，所述重组载体为anlp3-DSRed-SV40片段同基础载体 pBac [3xP3-EGFPafm]连接而成的 pBac [Bmlp3-DsRed_SV40，3xP3EGFP]显微注射载体。本发明的目的之四在于提供一种显微注射载体的制备方法，该方法操作简单。为实现上述目的，本发明的技术方案为
用于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，具体包括以下步骤
A、pMD19-Bmlp3的构建
如SEQ ID N0:1所示的家蚕anlp3基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19-Bmlp3 ；
B、pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]的构建
分别用EcoR I和BamH I双酶切pMD19_Bmlp3质粒，回收家蚕&iilp3基因启动子与分别用EcoR I和BamH I双酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成 pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]；
C、显微注射载体的制备
用Asc I 酶切步骤B所得pSL[an lp3-DsRed-SV40], 将切下的 Bmlp3-DsRed-SV40片段连接到Asc I酶切的pBac [3xP3_EGFPafm]基础载体，构建成 pBac [Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]显微注射载体。进一步，步骤A中，以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，其中，上游引物为5' -gga attccagtatagttacaacggctgcccc-3‘，下游引物为5' -cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatg t-3'；扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸80秒， 共30个循环；最后72 °C延伸10 min，得如SEQ ID NO: 1所示的家蚕&iilp3基因启动子，将其与载体PMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19_Bmlp3。本发明的目的之五在于提供pBac [anlp3-DsRed-SV40，3xP3EGFP]显微注射载体的运用，该运用该运用为开发家蚕脂肪体外源蛋白表达的生物反应器提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为
pBac[Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]显微注射载体在家蚕脂肪体中表达外源蛋白的应用。有益效果1)利用家蚕脂肪体蛋白质的高效合成与储存能力蚕的脂肪体非常发达，特别在五龄中后期至化蛹这段时间内，其脂肪体约占体重的30%。如果按一头蚕(五龄盛食期)平均体重为5g计算，其脂肪体蛋白含量最高可达到1. 5g左右。2)表达时期的可控性利用&iilp3基因启动子，可实现外源蛋白在脂肪体最为发达的发育阶段内进行表达；不管是在幼虫期还是蛹期，外源蛋白的特性不会受到影响。3)下游分离纯化的简便性脂肪体蛋白的分离纯化相对较为简单，在目前的工业生产和实验室研究中均有比较成熟的分离纯化技术体系。利用脂肪体表达的有用蛋白，甚至可不需纯化而直接将蚕幼虫或蛹加工成粉末，作为生产食品、保健品或动物饲料添加剂等的原材料；4)对传统产业的影响小自古以来，家蚕主要被用于生产蚕丝，按目前我国年均产蚕茧80万吨计算，每年可产生蚕蛹副产物约56万吨。如能利用蚕蛹脂肪体生产有用蛋白，既充分利用了工业生产中废弃的大量蚕蛹资源，又不会影响其主要的蚕丝生产，有利于显著提高产业的综合效益和农民养蚕收益。加之家蚕所具有的遗传背景清楚、高等真核生物的蛋白质后修饰加工、大规模生产成本低和对人畜安全等，满足了新一代生物反应器的基本要求，其开发潜力巨大。5)由piggBac 来源的转座子介导的转基因具有稳定性高、可遗传等特征，通过继代饲养可迅速扩大群体， 为外源蛋白纯化提供量上的保证。
图1为包含不同长度的aiilp3启动子的载体转染ail E细胞后的活性分析，Luc-Fl 到LUC-F7代表包含不同长度的&ιι1ρ3启动子的载体和pGL3-BasiC对照载体，箭头表示转录起始位点与转录方向；长方形表示TATA框，黑方框代表非翻译区，条纹框表示内含子；
图2为转基因家蚕个体的荧光观察后的灰度处理照片，a.卵(白光下)b.卵(荧光下)c.成虫(白光下)d.成虫(荧光下)；
图3为转基因家蚕个体的Southern blot分析，1为Gl代蚕蛾DNA {Hind III酶切)，2 为Gl代蚕蛾DNA (Bgl II酶切)，3为正常蚕蛾DNA (Bgl II酶切)。
图4为转基因家蚕的荧光观察的灰度处理照片，a，c, e, g, i, k为白光下观察，b， d, f, h, j, 1为荧光下观察；
图5为转基因蚕中红色荧光蛋白在不同组织中W^festern blot分析，1 Marker, 2对照，3丝腺，4中肠，5脂肪体，6标准品。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例1家蚕&iilp3基因启动子的获得
启动子元件的PCR扩增是以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板，根据设计的1ρ3 启动子上下游引物来扩增得到，具体构建如下
首先是启动子元件的获得&ιι1ρ3启动子由1ρ3基因5'-上游序列，外显子1，内含子 1和外显子2的17bp组成，它不含1ρ3基因的信号肽序列，由上下游引物以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板扩增获得，上游引物Ρ-f含有一个EcoR I位点5' -ggaattcCAGTAT AGTTACAACGGCTGCCCC-3 ‘，下游引物 Ρ-r 含有一个 BamH I 位点5 ‘ -cgggatccCGCGTCGAGT CCTGCAATATGT-3'，扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72 "C 延伸80秒，共30个循环；最后72 °C延伸10 min,4 °C保存。家蚕基因组中扩增获得的&iilp3启动子经克隆和测序验证，其序列长度为1 119bp。对克隆的&ιι1ρ3启动子序列进行分析发现该序列含有ifeTA 基因的第1外显子、第1 内含子、第2外显子的一部分、核心启动区域和5'端旁侧区，跨于基因的-374到+745位置，其DNA序列为
权利要求
1.家蚕anlp3基因启动子，其特征在于，所述家蚕aiilp3基因启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
2.权利要求1所述的家蚕&ιι1ρ3基因启动子在脂肪体中表达外源蛋白的运用。
3.根据权利要求2所述的运用，其特征在于，所述家蚕&ιι1ρ3基因启动子在脂肪体中表达红色荧光蛋白的运用。
4.含有权利要求1所述的家蚕anlp3基因启动子的重组载体，所述重组载体为anlp3-DsRed-SV40片段同基础载体pBac [3xP3-EGFPafm]连接而成的 pBac [Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]显微注射载体。
5.用于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤A、pMD19-Bmlp3的构建如SEQ ID NO: 1所示的家蚕anlp3基因启动子与载体pMD19_T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19-Bmlp3 ；B、pSL [Bmlp3-DsRed-SV40]的构建分别用EcoR I和BamH I双酶切pMD19_Bmlp3质粒，回收家蚕&iilp3基因启动子与分别用EcoR I和BamH I双酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成 pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]；C、显微注射载体的制备用Asc I 酶切步骤B所得pSL[an lp3-DsRed-SV40], 将切下的 Bmlp3-DsRed-SV40片段连接到Asc I酶切的pBac [3xP3_EGFPafm]基础载体，构建成 pBac [Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]显微注射载体。
6.根据权利要求5所述的于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，其特征在于，步骤A中，以家蚕基因组为模板进行PCR扩增，其中，上游引物为5' -ggaattcc agtatagttacaacggctgcccc-3‘，下游弓I物为5' _cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatgt_3‘；扩增条件为94 V预变性4分钟，94 V变性30秒，55 °C退火30秒，72 V延伸80秒，共30 个循环；最后72 °C延伸10 min，得如SEQ ID NO: 1所示的家蚕&iilp3基因启动子，将其与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19_Bmlp3。
7.pBac[Bmlp3-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]显微注射载体在家蚕脂肪体中表达外源蛋白的应用。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别涉及家蚕Bmlp3基因启动子，如SEQ ID NO:1所示，该启动子可用于在脂肪体中表达外源蛋白，本发明还包括用于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，具体为含有家蚕Bmlp3基因启动子的重组表达载体、表达框的构建及显微注射载体的制备；Bmlp3基因启动子可实现外源蛋白在脂肪体最为发达的发育阶段内进行表达，本方法可实现表达时期的可控性，由piggBac来源的转座子介导的转基因具有稳定性高、可遗传等特征，通过继代饲养可迅速扩大群体，为外源蛋白纯化提供量上的保证。
文档编号C12N15/66GK102191249SQ20111008374
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者夏庆友, 徐汉福, 邓党军, 马三垣 申请人:西南大学