专利名称：一种叔醇酯水解酶、编码基因、载体、工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种叔醇酯水解酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的载体、工程菌及其应用。
背景技术：
酯酶是一种能水解脂肪酸酯产生游离脂肪酸，将油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。酯酶作为一类重要的生物催化剂，因其具有选择性高、催化反应条件温和、无污染等特点，其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，酯酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，因此该酶的应用前景十分广阔。
近年来，将生物催化剂应用于有机相中催化化学反应已经成为生物催化领域中的研究热点。因其在有机相中催化具有诸多优点如底物在有机相中溶解度闻；广物易于回收；在有机相中能促进反应热力学平衡向正向移动；酶作为生物催化剂具有高度的区域选择性和立体选择性，在有机相中可一定程度上提升酶的立体选择性；生物催化酶在有机相中热稳定性增强，因而可以提高反应温度增加反应速度等等。酯酶作为一类广泛应用于医药、食品、化工等行业的重要生物催化剂，在有机相中的生物催化具有极其重要的应用，例如在有机相中低水环境下能催化合成难溶于水的医药中间体和精细化工品，能运用在一些重要药物中间体的手性拆分中等等。然而，大多数的生物催化酶在有机溶剂中酶活性会受到极大影响，使其难以实现规模化的工业生产。在有机介质中维持较高的酯酶活性及酯酶催化底物的广泛性，是当今生物催化过程中面临的难题。因此，开发高活性、有机溶剂稳定性强的酯酶具有巨大的应用潜能。叔醇底物是一类非常有价值的手性平台基化合物，可以广泛的用于药物中间体的合成，但是手性叔醇类底物具有较强的空间位阻，因此其化学合成工艺构建是十分具有挑战的，目前在大量合成高纯度的手性叔醇工艺开发上，尤其是绿色环保的工艺，仍然具有十分迫切的需要。近年来，人们发现具备GGG (A) X结构域特征的酯酶，因为在活性中心特异的苷氨酸侧链，可以提供一个较大的底物结合位点，能够高效的催化含有手性叔醇酯底物的水解，因此该类酯酶催化的手性叔醇酯底物的工艺具备广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种叔醇酯水解酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的载体、工程菌及其应用。该酶具备较高短碳链酯水解活性，较高的耐有机溶剂稳定性且在有机溶剂中活力提升特性，还具备催化水解手性叔醇酯底物的能力。本发明采用的技术方案是一种叔醇酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示(以下记为酯酶Est076)Met Ser Gln Leu Pro Ala Asp Leu Gln Glu Phe Met Glu Thr Leu
Arg Ala Pro Lys Gly Val Asn Pro Ala Glu Met Leu Gln Arg TyrAsp His Leu Met Asn Gly Asn Pro Pro Ala Val Gly Ala Val HisAsn Asp Val Leu Leu Arg Glu Val Gly Asn Trp Lys Val Thr AlaAsp lie Ser Val Pro Gln Gly Ala Glu Pro His Pro Val Leu ValTyr Phe His Gly Gly Gly Trp Thr Met Gly Ser Pro Lys Thr HisLeu Arg Val Gly Arg Glu Phe Ala Ala Gly Gly Tyr Leu Thr lieAsn Val Asp Tyr Arg Arg Ala Pro Lys His Arg Phe Pro Ala AlaPhe Asp Asp Cys Tyr Phe Ala Thr Gln Trp Ala Val Glu Asn AlaAla Arg Tyr Gly Gly Asp Pro Lys Arg Leu Ala Val Gly Gly AspSer Ala Gly Gly Asn Leu Ala Gly Gly Val Leu Ala Glu Ala ThrGln Lys Asn Gly Pro Gln lie Ser Val Gly Val Leu lie Tyr GlyVal Phe Asp Tyr His Lys Ala Leu Gly Ala Leu Gly Thr Thr GlyPro Ser Thr Gln Phe Tyr Leu Ala Glu Asp Gln Tyr Glu Ala LeuArg Gly Asp Pro Arg Val Ser Ser Phe Tyr Gly Cys Ser Lys PhePro Pro Cys Tyr lie Gly Val Gly Thr Lys Asp Pro Leu Leu ProGlu Ser Leu Ala Leu Ala Glu Lys Leu Lys Ser Leu Gly lie AspHis Asp Leu Gln Val lie Glu Gly Ala Pro His Gly Phe Phe GlnLeu Thr Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asp Gly Tyr Lys Arg Ala LeuAla Phe Met Asp Lys Tyr Leu Lys由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。编码所述叔醇酯水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。上述酯酶的编码基因为采用宏基因组功能筛选技术从土壤环境宏基因组文库中筛选获得。SEQ ID No. I 序列如下
atgagtcagc ttccagcaga tttacaagaa tttatggaaa cgttgcgggc gccgaaaggtgttaacccag cagagatgtt gcagcgatac gaccatctca tgaacggcaa cccgcctgcagtcggcgccg tgcataatga tgtcttgttg cgcgaggtgg gaaactggaa agtcaccgccgatatctccg tgccgcaagg ggcggaacca catcccgtgc ttgtctactt tcatggcggtggctggacga tgggcagtcc gaaaacccac ttacgtgtcg gcagagaatt tgccgcaggtggttatctga ctatcaacgt cgattaccgc cgcgctccca agcatcgttt tcctgcggcgtttgacgatt gctattttgc gacacagtgg gcggttgaga atgctgcacg gtatggtggtgatccgaaac gactagcggt cggcggtgat tccgctggag gaaacttggc cggcggcgtgttagccgagg cgacacagaa aaacgggcca cagatcagcg tcggcgtctt gatctatggcgtcttcgact accacaaagc gctgggcgct ttgggcacga ctggaccatc cacgcaattctatcttgcag aagaccaata cgaggcgtta cgcggcgacc ctcgtgtcag ctcgttttac
ggttgctcga agttcccacc gtgttacatt ggggtaggaa ccaaagaccc gctgctgccggagtcgctcg cgctcgccga aaaattaaag agcttgggca tcgatcatga cctacaggtcatcgaagggg cgccgcacgg cttttttcaa ttgacgccgc ttgctgctta cgctgacggctacaaacgag cgttagcgtt tatggacaag tatttgaagt aa由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO. I所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。本发明还涉及含有所述基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。本发明提供的酯酶Est076的表达载体是用常规方法将本发明的酯酶Est076基因的核苷酸序列连接于各个载体上构建而成，该载体可以使市售的质粒、粘粒、曬菌体或病毒载体等，如 pUC19, pREP, pBluescript (Stratagene), pQE (Qiagen), pSE420,pLEX (Invitrogen)和 pET(Novagen, Inc,Madison, Wis)，但不限于这些载体。优选的是将筛选获得的酯酶Est076基因连接至载体pET21a上得到重组表达载体。将包含本发明的酯酶Est076基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物中，即可得到所述基因工程菌。其宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。优选的是将包含酯酶Est076基因核苷酸序列的pET21a重组表达质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株。本发明还涉及所述基因在制备重组叔醇酯水解酶中的应用。本发明还涉及所述叔醇酯水解酶在水解乙酸芳樟酯制备芳樟醇中的应用。本发明提供的酯酶Est076具有较高的短碳链酯底物的水解活性，优选的是该酶在50°C，pH8. 5的Tris-HCl缓冲液中催化对硝基苯酚丁酸酯水解的酶活性高达3010U/mg，提示该酶在催化水解短碳链酯底物方面具有很大的活力优势。本发明提供的酯酶Est076具有较高的耐有机溶剂稳定性和在有机溶剂中活力提升特性。优选的是该酶在Log P>3的强有机溶剂正己烷、甲苯、二甲苯中分别室温孵育三天后，酶解对硝基苯酚丁酸酯底物的活性仍分别提高51%、44%、49%，可应用于生物、食品、医药、化工等行业的有机相中进行的相关酷催化反应。本发明提供的酯酶Est076具有催化水解手性叔醇酯底物的能力，能广泛水解如下式所示的不同的叔醇酯底物，本发明还涉及到该酯酶在水解式(I)所示叔醇酯制备式
(II)所示手性叔醇酯和式(III)所示手性叔醇中的应用；
权利要求
1.一种叔醇酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.编码如权利要求I所述叔醇酯水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQID No. I所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.一种用权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.权利要求2所述基因在制备重组叔醇酯水解酶中的应用。
6.权利要求I所述叔醇酯水解酶在水解乙酸芳樟酯制备芳樟醇中的应用。
7.权利要求I所述叔醇酯水解酶在水解式(I)所示叔醇酯制备式(II)所示手性叔醇酯和式(III)所示手性叔醇中的应用；
全文摘要
本发明提供了一种叔醇酯水解酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的载体、工程菌及其应用，该酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因如SEQ ID No.1所示。本发明叔醇酯水解酶具有很高的短碳链酯水解活性；在50℃，pH8.5的Tris-HCl缓冲液中催化对硝基苯酚丁酸酯水解的酶活性高达3010U/mg。该酯酶具有很高的耐强有机溶剂稳定性及活力提升特性，在Log P>3的强有机溶剂正己烷、甲苯、二甲苯中分别孵育三天后，酶活性仍分别提高51%、44%、49%。此外，该酯酶具备叔醇酯水解活性，能广泛水解不同的叔醇酯底物。本发明提供的酯酶、编码基因、载体以及重组菌可广泛应用于医药、食品、化工等行业中的有机相中的酯催化、叔醇底物相关的手性化合物合成及拆分等方面。
文档编号C12N15/63GK102796715SQ20121021164
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者王秋岩, 谢恬, 金鹏, 杜鹏飞, 熊小龙, 吴慧丽 申请人:杭州师范大学