专利名称：罗氏沼虾诺蒂病毒的lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及靶DNA片断的检测技术领域，具体涉及一种利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术快速检测罗氏沼奸诺蒂病毒所用的试剂盒及检测方法。
背景技术：
罗氏沼奸诺蒂病毒(Macrobrachiumrosenbergii Nudivirus,MRNuV)是引起罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的主要病原之一，对罗氏沼虾育苗产业危害极大。MRNuV为双链DNA病毒，属于诺蒂病毒属，国际上对该属病毒并为明确其科分类地位。该病毒于2010年从患罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的罗氏沼虾幼体中发现，其造成罗氏沼虾在幼体期出现大量死亡，特别是在幼体后期和变态为仔虾过程中尤为严重，死亡率一般为70 80%，严重的达到90%以上，近2年造成的经济损失无法估量。被发现以来，因缺少检测方法，严重阻碍 了该病毒引起疾病的预防工作，因此该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究显得尤为重要。因此，本发明米用环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术，通过检测罗氏沼虾诺蒂病毒的PIF-2基因，来检测罗氏沼虾诺蒂病毒，这是目前国内外首次建立的MRNuV检测方法。该方法的建立为罗氏沼虾幼体变态障碍综合症的预防奠定基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法的技术方案。本发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，其特征在于所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含弓I物MRNuV-FIP、弓丨物MRNuV-BIP、弓丨物MRNuV_F3、弓丨物MRNuV-B3、引物 MRNuV-LF 和引物 MRNuV-LB ；
所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO 1所示；
所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO 2所示；
所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO 3所示；
所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO 4所示；
所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO 5所示；
所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO 6所示。所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分含有5 15 mM Tris,0. 5 I. 5 mM EDTA ,pH 8. 0的TE缓冲液；RNaseA,浓度10 mg/mL ;蛋白酶K溶液,浓度20 mg/mL,pH8. 0 ； Tris饱和酹,pH8. 0 ;乙酸钠水溶液，浓度3 mol/L ；乙醇，浓度95%。所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应试剂包括以下组分
1)LAMP预反应液20 25mM pH为8. 2 9. O的Tris_HCl、5 IOmM硫酸镁、10 12mM 氯化钾、6 12mM 硫酸按、O. I O. 2% Triton X-100U I. 6 mM dNTP、0. 5 I. O M甜菜碱、1.5 2.2“]\1引物1 很1^-卩1 、1.5 2.24]\1引物1 很1^-81 、0· 15 O. 3μ M引物MRNuV-F3、0. 15 O. 3μΜ 引物 MRNuV-B3、0. 6 I. 2 μ M 引物 MRNuV-LF 和 O. 6 I. 2μ M 弓I物 MRNuV-LB ；
2)聚合酶每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶； 3)LAMP反应稳定液由矿物油或液体石蜡油组成；
4)LAMP反应显色液含有10 % SYBR Green I的荧光染料。所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒进行LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤
1)DNA抽提取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织抽提出待检测DNA的数
目；
2)罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增
①根据待检测DNA的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中I管为阳性对照，I管为阴性对照；
②吸取所述的LAMP预反应液的体积为NX23 μ L，加入一洁净的I. 5mL离心管中，然后加入Νμ L Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；
③向设定的N个LAMP反应管数中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各 IuL ；
④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uLLAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；
⑤在63°C下恒温反应30分钟；
3)显色检测
取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入I uL LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化或I. 5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色后进行观察。所述的LAMP检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为含有罗氏沼虾诺蒂病毒PIF-2基因的质颗，所述的阴性对照试样为无核酸去离子水。本发明所述的引物是根据在线软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/e/)设计和手工修改而得,本发明涉及的六条引物能特异识别祀序列的八个不同位点，增加了扩增的特异性，并在反应中产生茎环结构。本发明中罗氏沼虾诺蒂病毒PIF-2基因序列如SEQ ID NO 7所示，该序列为现有序列。与现有技术相比，本发明具有如下优点
(I)本发明根据靶基因序列设计了罗氏沼虾诺蒂病毒检测用引物组，能特异性识别靶序列上的八个独立区域，在BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应,在祀标DNA区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了罗氏沼虾诺蒂病毒检测的特异性；
(2)采用本发明的引物组对罗氏沼虾诺蒂病毒进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；
(3)本发明的快速诊断试剂盒是利用环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒，检测灵敏度高，扩增模板仅需12拷贝；
(4)本发明的快速诊断试剂盒不但反应条件温和，且所需仪器简单，也不需要特殊试齐U，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点；
(5)本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到Ih即可完成扩增，且产率高； (6)本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；
(7)本发明的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；
(8)本发明的快速诊断试剂盒建立了一套经过优化的环介导等温扩增反应体系，不但使得罗氏沼虾诺蒂病毒定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测罗氏沼虾诺蒂病毒的第一个试剂盒，填补了罗氏沼虾诺蒂病毒无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。
图I引物特异性测试 M DL 1000 DNA Marker ； I :罗氏沼虾诺蒂病毒；2 :正常罗氏沼虾DNA ； 3 :嗜水气单胞菌；4 :对虾白斑综合症病毒；5 :对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒；6 :阴性对照。图2灵敏性检测M :1000 bp DNA Marker ；1 1. 2X IO4 copies ;2 :1. 2X IO3 copies ；3 I. 2X IO2copies ；4 1. 2X 10 copies ；5 I. 2 copies ;6 :阴性对照。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。(I) DNA 抽提
取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织0. I 0. 2g，于冰上用研磨棒研磨，加 400 u L TE 缓冲液(含有 5 15 mM Tris,0. 5 I. 5 mM EDTA，pH 8. 0)和 I y L 浓度为lOmg/mL的RNase A后，继续研磨充分后加浓度为20mg/mL、pH值8. 0的蛋白酶K溶液20 ii L，旋涡震荡I分钟后，56°C水浴30min，加同体积pH值8. 0的Tris饱和酚，强烈振荡，IlOOOg离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0. I倍体积的浓度为3mol/L的乙酸钠，混匀，再加等体积的冰冷乙醇，混匀后低温静置10分钟，15000g离心5分钟，弃上清，沉淀用70%乙醇洗漆2次,室温干燥5 IOmin后以30 μ L去离子水重悬。(2)罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增
根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中I管为阳性对照(含有罗氏沼虾诺蒂病毒PIF-2基因的质粒)，I管为阴性对照(无核酸去离子水);吸取LAMP预反应液的体积为NX23 yL，加入一洁净的I. 5mL离心管中，然后加入N yL每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500 2000转/分钟离心10秒，向设定的N个反应管中分别加入24 u L混合液，并向N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各IuL;然后在每个反应管中再分别加入30 u L由矿物油或液体石蜡油组成的LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在63°C下恒温反应30分钟。(3)显色检测 取出经步骤(2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入I uL含有10 % SYBR Green I的荧光染料的LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。也可以用I. 5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有阶梯状的扩增特征条带，说明样品中有罗氏沼虾诺蒂病毒。上述LAMP预反应液含有20 25mM pH为8. 2 9. O的Tris_HCl、5 IOmM硫酸镁、10 12mM 氯化钾、6 12mM 硫酸按、O. I O. 2% Triton X-100U I. 6 mM dNTP、
O.5 I. O M甜菜碱、I. 5 2. 2yM$*MRNuV-FIP、L5 2.2y]\^|*MRNuV-BIP、0· 15
0.3yM$*MRNuV-F3、0. 15 O. 3 μ M引物MRNuV_B3、0. 6 I. 2 μ M引物MRNuV-LF和 O. 6
1.2 μ M引物MRNuV-LB，其中所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO 1所示；所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO 2所示；所述的引物MRNuV_F3序列如SEQ ID NO 3所示；所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO 4所示；所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO 5所示；所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO 6所示。MRNuV-FIP GTACCGGTAGTATTTTGTGGGATTAGAATTCCGTCATATTTACAGTTAAGGGGT ；
MRNuV-BIP CAAGCCGTTATAGCGGTTGCGAATTCCTTGTCGTACGAAATATCCAA ；
MRNuV-F3 CCGGTAATAATTCGTCTTCG ；
MRNuV-B3 AGCTACGGTTAATAGCGTTA ；
MRNuV-LB GGTTTCTCCACCAAACATAT ；
MRNuV-LF CGCTAACAATGAAGCCGTAG 采用上述快速诊断试剂盒和方法进行LAMP检测罗氏沼虾诺蒂病毒特异性和灵敏性试验结果如附图I和2所示。图I引物种特异性测试图，如图所示，仅罗氏沼虾诺蒂病毒能扩增出阶梯状的扩增特征条带，其它病毒无阶梯状的扩增特征条带，表明对其它病毒无交叉扩增性。图2罗氏沼奸诺蒂病毒灵敏性检测图，如图所示,经Real-time PCR定量后的罗氏沼虾诺蒂病毒DNA系列稀释的扩增特征条带显示，当反应体系中加入12个病毒拷贝的DNA，就能扩增出特征条带。本发明利用环介导等温扩增技术快速检测罗氏沼虾诺蒂病毒的检测方法，在已试验的4种不同的病毒(其中一个是诺蒂病毒)进行了检测，检测结果仅诺蒂病毒检测为阳性， 其它均为阴性，说明该检测方法特异性高。
权利要求
1.罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，其特征在于所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV_F3、引物MRNuV_B3、引物MRNuV-LF 和引物 MRNuV-LB ； 所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO 1所示； 所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO 2所示； 所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO 3所示； 所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO 4所示； 所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO 5所示；所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO 6所示。
2.如权利要求I所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分含有5 15 mM Tris,0. 5 I. 5 mM EDTA ,pH 8. 0的TE缓冲液；RNase A,浓度 10 mg/mL ;蛋白酶K溶液,浓度20 mg/mL, pH8. 0 ； Tris饱和酹，pH8. 0 ；乙酸钠水溶液，浓度3 mol/L ；乙醇，浓度95%。
3.如权利要求I所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应试剂包括以下组分 1)LAMP预反应液20 25mM pH为8. 2 9. 0的Tris_HCl、5 IOmM硫酸镁、10 12mM 氯化钾、6 12mM 硫酸按、0. I 0. 2% Triton X-100U I. 6 mM dNTP、0. 5 I. 0 M甜菜碱、I. 5 2. 2iiM 引物 MRNuV-FIP、l. 5 2. 2iiM 引物 MRNuV_BIP、0. 15 0. 3yM 引物MRNuV-F3、0. 15 0. 3 ii M 引物 MRNuV_B3、0. 6 ~ I. 2u M 引物 MRNuV-LF 和 0. 6 I. 2 y M 弓I物 MRNuV-LB ； 2)聚合酶每微升含8个活性单位的BstDNA聚合酶； 3)LAMP反应稳定液由矿物油或液体石蜡油组成； 4)LAMP反应显色液含有10 % SYBR Green I的荧光染料。
4.利用权利要求3所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒进行LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤 1)DNA抽提取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织抽提出待检测DNA的数目； 2)罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增 ①根据待检测DNA的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中I管为阳性对照，I管为阴性对照； ②吸取所述的LAMP预反应液的体积为NX23 u L，加入一洁净的I. 5mL离心管中，然后加入Ni L Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500 2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液； ③向设定的N个LAMP反应管数中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各 IuL ； ④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uLLAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒； ⑤在63°C下恒温反应30分钟；3)显色检测 取出经步骤2)的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入 I uL LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化或I. 5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色后进行观察。
全文摘要
罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法，属于靶DNA片断的检测技术领域。该LAMP检测试剂盒包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV-F3、引物MRNuV-B3、引物MRNuV-LF和引物MRNuV-LB。发明的试剂盒特异性强，敏感性高；本发明罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测方法利用所述试剂盒检测，该方法方便、灵敏、准确、快速。
文档编号C12Q1/70GK102796829SQ20121030457
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者潘晓艺, 沈锦玉, 蔺凌云, 姚嘉赟, 徐洋, 袁雪梅, 郝贵杰, 尹文林 申请人:浙江省淡水水产研究所