专利名称：转基因玉米bt11品系的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种食品中转基因玉米BTll品系环介导等温扩增(LAMP )引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首。世界范围内玉米害虫高达350多种，其中以鳞翅目的玉米螟分布最广、危害最重，是世界性的重要玉米害虫，其严重影响着玉米的产量和品质。近十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种，在改善农作物生产中发挥了明显的作用，也显露出巨大的潜力。然而，人们对转基因玉米的安全性存在着很多的争论。面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因玉米进行检测具有重要的 现实意义。2009年，我国已经解除了对玉米进口的限制，大批量的玉米已经涌入中国。这势必对我国的农业安全带来冲击。Btll转基因玉米品系是瑞士先正达种子有限公司研发的产品，是DNA直接转化先天玉米品系H8540，并在选择性培养基上培养而出的，具有抗欧洲玉米螟(ECB;0strinianubilalis)的抗性，也可以抗草甘膦除草剂。在2004年4月6日首次获得中国农业部颁发的安全证书，是目前用于加工食品和饲料最多的品系之一。目前，转基因玉米成分检测方法主要为TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐，污染环境、灵敏度低等不足已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。但是TaqMan实时荧光PCR检测对技术要求相对较高且成本昂贵，目前急需制定在检验检疫一线的基层实验室能够普遍适用的快速、简便、准确的标准检测方法。国内发布的食品转基因玉米BTll品系特异性检测标准有GB/T 19495. 5 一 2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》、SN/T 1196-2003《玉米中转基因成分定性PCR检测方法》、SN/T 1201-2003《植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法》和农业部869号公告-3-2007《转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Btll及其衍生品种定性PCR方法》，这4个标准均采用实时荧光PCR方法或普通PCR方法。国外发布的转基因玉米BTll品系特异性检测技术是欧盟发布的官方检测方法“Event-specific Method for the Quantification of Maize Line BtlI UsingReal-time PCR(CRLVL10/07VP) ”，该方法采用的是实时荧光PCR方法。国内外相关标准的要求由于欧盟是最为关注食品转基因成分的地区，多年来不断更新检验监管规定和检测技术要求，因此玉米转基因BTll品系的标准检测方法历来主要依据欧盟规定的方法，国内相关标准也是参考欧盟的技术文件制定的。目前，转基因玉米BTll品系标准检测方法的文献依据是欧盟发布的官方方法“Event-specific Method for the Quantification of MaizeLine Btll Using Real-time PCR(CRLVL10/07VP)’’，国内的 GB/T 19495. 5 — 2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》也规定了同样的技术内容。这些方法采用的均是TaqMan实时荧光PCR方法，最低检出限为O. 5%。随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的新型鉴定技术已日益得到广泛应用。环介导等温扩增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基础上创建的一种较理想的手段，其特点是①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性采用六个区段，四条引物，扩增特异性高，可以根据是否扩增来判断目标基因的存在与否；③快速、高效扩增扩增在不到Ih即可完成，且产率高；④灵敏度高扩增模板可达10拷贝或更少；⑤鉴定简便在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可用肉眼观察判断扩增与否；另外，它利用恒温和低反应温度(63°C)，减少细胞损伤，检测人员实际操作非常简便。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测等领域具有广阔的应用前景。目前尚未发现LAMP方法应用于食品转基因成分检测的标准化研究。
发明内容
本发明的技术方案为通过考察并锁定转基因玉米BTll品系靶基因，转基因玉米BTll品系外源基因和玉米边界序列(AY123624. I)中的SEQ ID NO 1序列，然后设计合成4套特异性LAMP引物，优化体系，最后确定一套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID NO 2 7 ;进而确定了 LAMP方法的技术参数，最后室内外验证验证引物特异性、灵敏度、稳定性。本发明的具体技术方案如下本发明涉及一种检测转基因玉米BTll品系的环介导等温扩增引物，其碱基序列为 SEQID NO :2 7，如表 I 表I转基因玉米品系LAMP BTll弓丨物
权利要求
1.一种检测转基因玉米BTll品系的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO -.2 。
2.—种转基因玉米BTll品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物SEQ ID NO :2 7。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米BTll品系的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，在检测试剂盒中每 25μ L的LAMP 反应体系包括SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ ID NO :4 5 各 I. 6 μ Μ、SEQ ID NO :6 7 各 0· 8 μ Μ、I X ThermoPol 缓冲液、0. 8mM 甜菜碱、I. 4mM dNTP、8UBst DNA 大片段聚合酶； 其中上述 IXThermoPol 缓冲液为IOmM KCl,20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4 和 O. l%Triton X-IOO0
4.利用权利要求2所述试剂盒检测转基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，检测步骤包括 ①分别提取BTll转基因玉米品系标准样品和待测样品的基因组DNA； ②分别以步骤①精提的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测 每 25yL 的LAMP反应体系，其包括DNA 模板 200ng、SEQ ID NO :2 3 各 O. 2 μ M、SEQ IDNO :4 5 各 I. 6 μ M、SEQ ID NO :6 7 各 0· 8 μ Μ、I X ThermoPol 缓冲液、0. 8mM 甜菜碱、I. 4mMdNTP、8U Bst DNA大片段聚合酶、蒸馏水余量； 其中上述 IXThermoPol 缓冲液为IOmM KCl,20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl，IOmM(NH4) 2S04,2mM MgSO4 和 O. l%Triton X-IOO ； 反应条件为63°C恒温反应60min，80°C下保温5min ； ③环介导等温扩增法的检测结果以肉眼、浊度法或显色法进行判断。
5.根据权利要求4所述的检测转基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，所述步骤③中的浊度法利用LAMP实时浊度仪完成。
6.根据权利要求4所述的检测转基因玉米BTll品系的方法，其特征在于，所述步骤③中的显色法使用荧光染料SYBR Green I。
全文摘要
本发明公开一种转基因玉米BT11品系的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用，所述的LAMP检测所用的引物，其碱基序列如SEQIDNO2~7；采用LAMP检测技术，结合浊度法或显色法，建立了适用于食品中转基因玉米BT11品系特异性检测标准方法，本发明所述方法操作简单，不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，检测效率达到传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。
文档编号C12Q1/68GK102827939SQ201210330429
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者徐君怡, 曹际娟, 郑秋月, 赵昕 申请人:徐君怡, 曹际娟, 郑秋月, 赵昕