专利名称：一种gap基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种GAP基因启动子，特别是一种来源于产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)的启动子。
背景技术：
产甘油假丝酵母(Candida glycerolgenesis，CCTCC M93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日，具有耐高渗、高产量，高转化率，生产强度大的特点，居世界领先地位。它能在25%葡萄糖或5% NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，在实验室规模发酵中，甘油产量可达到12%，即使在工业化规模中，甘油产量也可达10%，这是用酿酒酵母甘油代谢理论难以解释的。基因表达的最终产物是RNA和蛋白质，任何基因表达调控程序上的缺陷或紊乱，均会对生物体造成严重后果。因此，基因表达调控的机理研究是分子生物学研究的热点和前沿。编码蛋白质基因的表达需要转录和翻译两个环节，每个环节都存在着不同的基因表达调控位点。而启动子的调控在转录环节又占有十分重要的地位。因此，研究启动子的功能对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。强启动子对于高效基因表达是必需的。启动子区对驱动和调节基因表达而言是必需的。这些DNA序列的延伸通常发现在基因开放阅读框架的上游。启动子中的关键遗传元件包含增强子位点、沉默子位点、上游活化子序列、转录因子结合位点和RNA聚合酶结合位点。这些元件对指定生物体的外部环境作出应答从而根据生长条件调节基因表达。获得高效启动子具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的产甘油假丝酵母基因及其启动子序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I。如上所述的多核苷酸序列SEQ ID NO. I，来源于产甘油假丝酵母3_磷酸甘油醛脱氢酶基因表达框。包含所述启动子的载体，例如表达载体、克隆载体及穿梭载体均为本专利的保护范围。本发明提供的载体可应用于酵母表达系统；功能基因的筛选(基因克隆于启动子后)、鉴定及优化；调控基因的表达；功能基因的稳定表达(基因克隆于启动子后)或过表达(采用多个启动子或启动胁迫机制)。上述关于启动子的常规应用均属于本发明的保护范围。产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度的验证3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度的的重组表达载体(图I)，构建过程如下
(I)PCR克隆或采用化学全合成的方法将产甘油假丝酵母CgGAP基因启动子PcgGAP 连到质粒载体 PYX212 (Regenberg, B.，L. During-Olsen, M. C. Kielland-Brandt andS. Holmberg, (1999)Substrate specificity and gene expression of the amino-acid permeasesin Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 36 :317-328.)上，得到载体 PYX212_PGgGAP ;(2)将绿色荧光蛋白基因GFP，连接到载体PYX212_PCgeAP上，得到载体PYX212-PCgGAF-GFP ；(3)将zeocin抗性基因连接到载体PYX212-PCgGAp-GFP上，得到载体PYX212-zeocin-PCgGAP-GFP ；通过构建的重组表达载体PYX212-zeocin-PegeAp-GFP，重组质粒用热击方法转化酿酒酵母(ATCC 4098 )，涂布含有zeocin的YETO抗性平板。从YETO抗性平板上挑取单菌落，转接添加zeocin(150ug/mL)的YEF1D液体培养基,提取质粒,验证阳性转化子。 从平板上挑取阳性克隆，接种于IOmL含有150ug/mL zeocin的YETO液体培养基中。30°C培养20h，离心收集菌体，转接入IOmL的YEH)液体培养基中。30°C培养24h，摇床转数 200r/min。利用Olympus荧光显微镜进行荧光分析。以绿色荧光蛋白为标记证实了构建的整合表达载体的实用性及可行性，进一步验证了产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度。本发明的有益效果本发明提供了一种高效的启动子序列，能广泛应用于基因表达、功能基因的筛选研究。
图I :PYX212-zeocin-PCgGAp-GFP 物理图谱；图2 :产甘油假丝酵母GAP基因启动子表达强度的荧光验证图(A)野生酿酒酵母作对照；(B)转化质粒 PYX212-zeocin-PCgGAp-GFP 的重组酿酒酵母；
具体实施例方式下面通过具体的实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。实施例I :简并引物PCR扩增Candida glycerinogenes的3_磷酸甘油醒脱氢酶基因片段I.简并引物的设计搜索GeneBank公布的相关酵母和其他真核生物的序列，通过氨基酸序列的比对分析，找到两个保守区域对应的氨基酸序列为IKVGINGF和YDNEYGYSTR，根据这两个保守区域设计一对简并引物GAPl TBRTB GGITCHGGYAAYTGGGGAP2 RGCVAYVAYRTTYTTYARIGC2. Candida glycerigenes 基因组 DNA 的提取
产甘油假丝酵母(CCTCC M93018)染色体DNA制备按参考文献[酵母遗传学技术手册]进行。将提取的DNA用DU640核酸蛋白分析仪进行测定，根据A26tlA28tl的比值判断所提取的DNA纯度，利用260nm下的OD值计算所提取的DNA浓度，同时，通过琼脂糖凝胶电泳判定模板的质量。3. PCR 扩增PCR获得片段长度约为O. 93kb的核酸分子，胶回收后按pGEM-T-Easy (Promega)试 剂盒操作说明进行TA克隆，测序结果获得一个的序列。实施例2 :反向引物PCR扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长序列I.反向PCR引物的设计根据简并引物PCR扩增获得的序列结果，设计一对反向PCR引物GAPICCTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTGGAPF CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC2. PCR模板的制备按上述方法提取C. glycerinogenes的基因组DNA,分别用限制酶Sac I各酶切5ug基因组DNA，琼脂糖电泳检查酶切效果。用I : I的酚和氯仿等体积抽提酶切产物，然后用
2.5倍体积的无水乙醇沉淀，最后溶于50uL超纯水中。在200uL连接体系中，加入O. Iug酶切的DNA，20uL的连接缓冲液和IOU T4DNA连接酶，用水补足体积，16°C过夜。连接产物用无水乙醇沉淀后，溶于25uL无菌超纯水中，用于下一步反向PCR扩增。3.反向PCR扩增反向PCR扩增,测序结果经拼接后获得全长的C. glycerinogenes基因序列和启动子。实施例3 C. glycerinogenes基因序列信息和同源性分析本发明产甘油假丝酵母的核苷酸序列全长，详细序列见SEQ ID NO. I，内部编码框内不含有内含子。将产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因序列及其编码蛋白用BLAST程序，数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因与其它酵母的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因在蛋白质水平上存在较高的同源性，属于同一家庭蛋白。实施例4 :产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的结构和功能将产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的氨基酸在blocks数据库(http: //www. blocks, fhcrc. org)中检索结构域。用在线预测软件(http:/www. psort. nibb. ac. jp)进行蛋白的亚细胞定位分析。实施例5 :产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度的验证构建的重组表达载体和对照载体，参见附图I。具体构建过程(I)PCR克隆产甘油假丝酵母GAP基因启动子Pwmp连到质粒载体PYX212 (Regenberg, B. , L. During-Olsen, M. C. Kielland-Brandt and S. Holmberg, (1999)Substrate specificity and geneexpression of the amino-acid permeases inSaccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 36 :317-328.)的 BamH I、Hind III 上，得到载体PYX212-PCgGAP ；
(2)根据质粒载体pCAMBIA1302公布的序列合成绿色荧光蛋白基因GFP，连接到载体 PYX212-PCgeAP 的 Hind III、Sac I 上，得到载体 PYX212-PCgeAP-GFP ； (3)根据质粒载体pPGAPZb公布的序列合成zeocin抗性基因连接到载体PYX212-PCgGAP-GFP 的 EcoR I 上，得到载体 PYX212-zeocin_PCgGAP-GFP ；实施例6 :重组表达载体的转化和筛选通过构建的重组表达载体PYX212-zeocin-Peg(；Ap-GF，重组质粒用热击方法转化酿酒酵母，涂布含有zeocin的YEH)抗性平板。从YETO抗性平板上挑取单菌落，转接添加zeocin(150ug/mL)的YEF1D液体培养基,提取质粒,验证阳性转化子。实施例7 :酵母培养、诱导表达和突光分析从平板上挑取阳性克隆，接种于IOmL含有150ug/mL zeocin的YETO液体培养基中。30°C培养20h，离心收集菌体，转接入IOmL的YEH)液体培养基中。30°C培养24h，摇床转数 200r/min。·利用Olympus荧光显微镜进行荧光分析。绿色荧光蛋白是一种极具潜力的标记物，其内源荧光基因在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光且荧光性质稳定，与现有的标记物相比，gfp具有无可比拟的优势。因而自gfp被发现以来，一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白定位的理想标记。本发明以绿色荧光蛋白为标记证实了构建的整合表达载体的实用性及可行性，进一步验证了产甘油假丝酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子表达强度(图2)。
权利要求
1.一种GAP基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的启动子，特征在于来源于产甘油假丝酵母染色体基因组。
3.权利要求I所述启动子的克隆，以产甘油假丝酵母染色体基因组DNA为模板，通过采用简并引物PCR和反向PCR法从产甘油假丝酵母基因组DNA中克隆出3-磷酸甘油醛脱氢酶基因及其启动子序列。
4.含有权利要求I所述启动子的载体，其特征在于，为表达载体、克隆载体及穿梭载体。
5.权利要求I所述的启动子应用于酵母、植物表达系统。
6.权利要求I或2所述的启动子应用于功能基因的筛选、鉴定及优化。
7.权利要求I或2所述的启动子应用于调控基因的表达。
8.权利要求I或2所述的启动子应用于功能基因的稳定表达或过量表达。
9.权利要求I或2所述的启动子应用于产甘油假丝酵母高产甘油的研究。
全文摘要
本发明公开了一种GAP启动子基因及其应用，属于微生物分子生物学领域。本发明提供的启动子序列如SEQ ID NO.1所示，来源于产甘油假丝酵母WL2002-5-59。该基因及其启动子的克隆扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母高产甘油的分子机理研究奠定了基础。含有本发明启动子序列的应用如表达载体可构建为筛选细胞转化的标志，用于评估基因克隆的效率。作为产甘油假丝酵母基因敲除的工具，进行菌种改良，产生更安全及更具产业利用性的产甘油假丝酵母种。
文档编号C12N15/113GK102952800SQ20121045224
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者诸葛斌, 张 成, 方慧英, 宗红, 诸葛健 申请人:江南大学