用于双色实时荧光pcr快速检测细菌的探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用，所述探针序列如下：革兰阴性细菌探针ACAGCCATGCAGCA，革兰阳性细菌探针ACAACCATGCACCA。本发明可以简便、快速检测细菌，检测灵敏度较高，且检测费用相对较低。
【专利说明】用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用
【背景技术】
[0001]传统微生物培养与鉴定方法有以下局限性:鉴定时间过长，病原微生物的分离培养成功率不高，即鉴定的假阴性率较高，对于生长缓慢的微生物、苛养菌等难培养微生物，培养的敏感性很差，多种病原菌共同存在时，尤其是同时存在厌氧菌时，容易出现病原菌的漏检。因此，目前急需简便、快速、有效、相对价廉的病原微生物快速检测技术。
【发明内容】
[0002]本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一组用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针及其应用，本发明可以简便、快速检测细菌，检测灵敏度较高，且检测费用相对较低。
[0003]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0004]一组用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针，序列如下:
[0005]革兰阴性细菌探针:5’ACAGCCATGCAGCA3’ 14碱基对，
[0006]革兰阳性细菌探针:5’ACAACCATGCACCA3’ 14碱基对。
[0007]—种使用所述探针快速检测细菌的方法，包括以下具体步骤:
[0008]1、通用引物、革 兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针的设计与标记:
[0009]用临床常见病原菌的16SrRNA基因序列，查找其共同的保守区和变异区，设计一对通用引物、一条革兰阴性细菌探针和一条革兰阳性细菌探针，序列如下:
[0010]引物1:5’ GATGCAACGCGAAGAACCTTAC3’ 22 碱基对
[0011]引物2:5 ’ TGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC3 ’ 22 碱基对
[0012]革兰阴性细菌探针:5’ACAGCCATGCAGCA3’ 14碱基对
[0013]革兰阳性细菌探针:5’ACAACCATGCACCA3’ 14碱基对
[0014]MGB方法标记探针，革兰阴性细菌探针标记FAM，革兰阳性细菌探针标记HEX ；
[0015]2、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针对临床病原菌的覆盖范围是:40种革兰阴性细菌和21种革兰阳性细菌，见表1 ;
[0016]表161种临床病原性细菌
[0017]
【权利要求】
1.一种用于双色实时荧光PCR快速检测细菌的探针，序列如下: 革兰阴性细菌探针:ACAGCCATGCAGCA 革兰阳性细菌探针:ACAACCATGCACCA。
2.一种使用权利要求1所述探针快速检测细菌的方法，包括以下具体步骤: 1)、通用引物、革兰阴性细菌探针和革兰阳性细菌探针的设计与标记: 用临床常见病原菌的16SrRNA基因序列，查找其共同的保守区和变异区，设计一对通用引物、一条革兰阴性细菌探针和一条革兰阳性细菌探针，序列如下:
引物 1:GATGCAACGCGAAGAACCTTAC
引物 2:TGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC 革兰阴性细菌探针:ACAGCCATGCAGCA 革兰阳性细菌探针:ACAACCATGCACCA MGB方法标记探针，革兰阴性细菌探针标记FAM，革兰阳性细菌探针标记HEX ； 2)、所设计的通用引物细菌特异性和通用性验证 提取各种细菌和非细菌病原微生物以及人基因组DNA，用步骤I中的引物，按照以下实验步骤进行通用引物的特异性和通用性验证:` (1)菌株复活 挑取适量微生物室冰冻保存的菌株，按五区划线接种于营养琼脂平板；流感嗜血杆菌接种于巧克力平板，CO2培养箱过夜培养获得菌落； (2)菌株DNA提取 用无菌环分别刮取平板上的I个菌落置于Iml无菌离心管中，充分混匀后，离心，弃上清，取50ul菌株液加等量的细菌提取裂解液，100°C煮沸10min，12000r / min离心5min，取上清液做PCR模板； (3)反应体系 反应总体积50ul，IOuM引物各2ul，25mM镁离子7ul，IOmM dNTP4ul，IU的Taq酶，buffer5ul,模板 5ul ； (4)扩增条件 94°C预变性 5min，94°C变性 40sec，退火 30sec，72°C延伸 lmin，72°C后延伸 5min，循环33次； (5)扩增产物电泳分析 2%琼脂糖熔胶后加入2ul溴乙锭，灌胶后，取8.5ul扩增产物加1.5ul溴酚兰后上样，75伏特电泳50min，用凝胶成像系统观察结果； 3)、用通过验证的引物和标记探针，构建并优化MGB探针双色实时荧光PCR反应体系，扩增条件如下:
反应总体积 25ul, IOuM 引物各 1.0ul，IOuM G-Probe 和 G+Probe 各 0.5ul，模板 2.5ul,2.5XRealMasterMixlOul, 20XProbe Enhancer Solutionl.25ul,超纯水补足，扩增条件为:94°C预变性2min，94°C 20sec、60°C 60sec为一个循环,共40个循环。
【文档编号】C12Q1/04GK103509862SQ201310368062
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】胡大春, 吉永, 赵晓丽 申请人:胡大春, 吉永, 赵晓丽