一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法，属于生物工程【技术领域】，是将来源于米曲霉JN-412（CGMCC?No.8474）的编码成熟脯氨酸氨肽酶基因导入E.coli?BL21(DE3)得到的基因工程菌。上述基因工程菌能高效表达脯氨酸氨肽酶，发酵液上清中的酶活为25.87U/mL，比酶活为40.87U/mg，为后期研究脯氨酸氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。
【专利说明】一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法，属于基因工程及酶工程研究领域。
【背景技术】
[0002]米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种好气性真菌,分类学归属于半知菌亚门、曲霉属，能够分泌大量的酶，是一种非常有用的发酵工业菌，广泛用于生产发酵食品。2005年，A.0ryzae RIB40 菌株的全基因组已测序完成(http://www.bi0.nite.g0.jp/dogan/project/view/A0)。研究人员根据全基因序列，推断出134种蛋白酶类似基因，其中有69个基因编码外肽酶。
[0003]外肽酶根据其所剪切肽链末端为氨基端或羧基端可分为氨肽酶和羧肽酶。其中，氨肽酶(aminopeptidases,简称APs,EC3.4.11.)是一类从多肽链的N端顺序逐个水解氨基酸的酶。在食品工业中，氨肽酶通常与蛋白酶复合使用，广泛用于调味品和干酪的生产、蛋白水解液的脱苦、蛋白质深度水解和多肽制备等方面。随着食品工业的发展，氨肽酶的应用呈现出愈来愈广阔的前景。
[0004]本发明中重组大肠杆菌所表达的脯氨酸氨肽酶(prolyl aminopeptidase,简称PAP, EC3.4.11.5)特异性地水解蛋白和多肽的氮端脯氨酸残基,这一特性使得脯氨酸氨肽酶在消化富含脯氨酸的 多肽和蛋白质(如胶原蛋白和明胶)方面有重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供:一种表达脯氨酸氨肽酶的基因工程菌，是将来源于A.0ryzae JN-412 (CGMCC N0.8474)的正确的编码脯氨酸氨肽酶基因的全长cDNA序列导入E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌。利用构建好的工程菌发酵制备重组脯氨酸氨肽酶，并研究重组脯氨酸氨肽酶的基本酶学性质。
[0006]所述的A.0ryzae JN-412 (CGMCC N0.8474)，由本研究室筛选于日式成曲，于2013年11月15日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.8474，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0007]所述编码脯氨酸氨肽酶基因的全长cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本发明还提供了一种上述基因工程菌的构建方法，具体方法如下:
[0009]I)从A.0ryzae JN-412 (CGMCC N0.8474)中提取高质量的总RNA，并使用反转录技术利用总RNA为模板合成双链cDNA ；
[0010]2)根据pap基因的特异性设计引物，并利用PCR扩增的方法克隆得到pap基因，将pap基因与pMD19-T于16°C过夜连接，连接产物转化E.coli DH5a，得到重组质粒pMD19_pap，送上海生工测序；
[0011]3)将重组质粒pMD19_pap与空载pET_28a(+)分别进行双酶切，并胶回收酶切产物。将胶回收产物于16°C过夜连接，转化E.coli BL21(DE3)。挑选阳性克隆。[0012]具体技术方案为:
[0013]I)根据pap基因的特异性设计引物，以双链cDNA为模板，克隆目的基因；PCR体系为:1011]\1引物？1和？2个21^，模板2111^1^11^141? Max DNA聚合酶25 y L，双蒸水补齐 50ii L ;PCR 条件:98°C预变性 5min ;98°C变性 10s，59。。退火 5s，72。。延伸 90s, 38 个循环；72°C后延伸IOmin ;目的基因PCR产物胶回收，末端加“A”，反应体系为:胶回收DNA片g 25 u L,10XPCR buffer5 y L, dNTPs4 y L，双蒸水补足 50 y L ;反应条件为:72°C,30min ；将加“A”后的DNA片段与T Vector pMD 19_T (Simple)混合，于16°C过夜连接，转化E.coliDH5 a，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑去20个转化子，提取重组质粒并就行质粒PCR和双酶切验证后送上海生工测序，重组质粒即pMD19-pap ；
[0014]2)将重组质粒pMD19_pap和空载pET_28a(+)分别进行双酶切，并将酶切产物进行胶回收。胶回收产物于16°C过夜连接，转化E.coli DH5 a，在含卡那霉素抗性的LB平板挑取转化子，提取重组质粒并就行PCR和双酶切验证后测序，重组质粒即pET-28a (+) -pap ;将阳性克隆转化E.coli BL21 (DE3)，在含卡那霉素抗性的LB平板挑取单菌落做表达验证。
[0015]本发明提供了一种产脯氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌能高效表达脯氨酸氨肽酶，发酵液上清中的酶活为25.87U/mL,比酶活为40.87U/mg,为后期研究脯氨酸氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1米曲霉脯氨酸氨肽酶基因克隆结果(1:目的基因)。
[0017]图2重组质粒pMD19_pap单酶切和双酶切结果(1:pMD19-pap，2:pMD19，3:目的基因)。
`[0018]图3重组质粒pET-28a(+)_pap双酶切结果(1:pET_28a (+)，2:目的基因)。
[0019]图4重组大肠杆菌表达SDS-PAGE结果(M:低分子量蛋白标准，1:诱导E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)细胞破碎后上清，2:诱导 E.coli BL21 (DE3)/pET_28a (+)细胞破碎后沉淀，3:非诱导E.coli BL21 (DE3)/pET-28a(+)-pap细胞破碎后上清，4:非诱导E.coliBL21 (DE3) /pET-28a (+) -pap 细胞破碎后沉淀，5:诱导 E.coli BL21 (DE3)/pET_28a (+)-pap细胞破碎后上清，6:诱导E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-pap细胞破碎后沉淀，7:目的蛋白)。
[0020]图5重组脯氨酸氨肽酶最适反应pH[0021 ] 图6重组脯氨酸氨肽酶pH稳定性
[0022]图7重组脯氨酸氨肽酶最适反应温度
[0023]图8重组脯氨酸氨肽酶热稳定性
【具体实施方式】:
[0024]材料和检测方法
[0025]YPD培养基:1%酵母膏，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，pH6.0。
[0026]LB培养基:1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，pH7.0。
[0027]大肠杆菌E.coli DH5a 和 E.coli BL21 (DE3)本研究室保藏，A.0ryzae JN-412(CGMCC N0.8474)筛选自酱油曲。[0028]RNAiso Plus 和 cDNA Synthesis Kit(M_MLV Version)购自宝生物工程(大连)有限公司。pMD19T_simple vector、T4DNA连接酶和10 X T4连接酶Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，pET-28a(+)本研究室保存。
[0029]限制性内切酶Not I和BamH I以及共用Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0030]其他原料和试剂均为市售国产或进口分析纯产品。
[0031]脯氨酸氨肽酶活性测定方法:以L-脯氨酸-对硝基苯胺为底物，在50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液中加入稀释一定倍数的酶液和底物2.5mM，50°C水浴反应lOmin，在405nm下测定吸光度。酶活定义:在50°C下，Imin分解L-脯氨酸-对硝基苯胺产生I U M对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位(W。
[0032]实施例1:脯氨酸氨肽酶基因的克隆及重组菌E.coli BL21 (DE3)/pET_28a(+)-pap
[0033]以A.0ryzae JN-412 (CGMCC N0.8474)的总RNA为模板，根据反转录试剂盒提供的操作条件合成双链cDNA。
[0034]以上述合成的双链cDNA为模板，运用PCR的方法克隆得到脯氨酸氨肽酶基因pap，并与载体pMD19T-simple连接得到载体pMD19_pap,将克隆载体转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5 a，挑选阳性克隆，测序验证，其碱基序列:如SEQ ID N0.1所示。
[0035]用BamH I和Not I对重组质粒pMD19_pap和空质粒pET_28a(+)进行双酶切并胶回收，胶回收产物于16°C过夜连接。转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5a，挑取阳性克隆，提质粒，用BamHI和Not I双酶切验证，送上海生工测序。将构建好的重组质粒pET-28a(+)-pap转化E.coli BL21 (DE3)，挑选阳性克隆，提质粒，用BamH I和Not I双酶切验证 E.coli BL21 (DE3)/pET-28a(+)-pap 重组菌构建成功。
[0036]实施例2:重组菌的表达验证
[0037]挑取单菌落于5mL LB培养基(卡那霉素50y g/mL)中，37°C、200rpm过夜培养，再按1%的接种量转接至50mL LB培养基(卡那霉素50 u g/mL)中37°C、200rpm培养至OD6tltl值在0.8~1.0之间，加入IPTG至终浓度0.5mM，25°C、200rpm培养6h后，10，OOOrpm离心3min,弃上清，细胞沉淀用40mL50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液重新悬浮，超声破碎，离心收集上清，进行酶活和SDS-PAGE验证。测得上清的酶活为25.87U/mL,比酶活为40.87U/mg。对照组以含有空载体pET-28a (+)的BL21 (DE3)菌株以及不加IPTG诱导的含有pET-28a(+)-pap重组子BL21 (DE3)菌株，其余条件同上，SDS-PAGE结果见图4。
[0038]实施例3:重组脯氨酸氨肽酶的酶学性质研究
[0039]实施例2中的粗酶液经纯化获得的纯酶液，该酶液用于酶学性质研究，结果发现:
[0040]I)最适反应pH及pH稳定性
[0041 ] 在四种缓冲液体系(IOOmM柠檬酸缓冲液pH3-6 ； IOOmM磷酸盐缓冲液pH6_8 ；IOOmM Tris-HCl缓冲液pH7_9 ；IOOmM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH9_ll)下检测酶活。结果见图6，从图上可以看出，重组脯氨酸氨肽酶在IOOmM Tris-HCl pH7.5时表现出最高酶活。
[0042]在 三种缓冲液体系下(IOOmM柠檬酸缓冲液pH3-6 ;IOOmM磷酸盐缓冲液pH6_8 ；IOOmM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH9-lI )，将纯酶液在缓冲体系中30°C保温lh，标准方法测得的酶活为100%。结果见图7，从图中可以看出，该酶在PH5-11之间有很好的稳定性，相对酶活均在80%以上。
[0043]2)最适反应温度及热稳定性
[0044]在301:、401:、501:、601:和701:条件下检测酶活，酶活最高者为100%，结果见图8，从图上可以看出，60°C是该酶的最适反应温度。 [0045]在30°C、40°C、50°C和60°C条件下，纯酶液保温lh，标准方法检测酶活，以4°C保温的纯酶液为对照。该酶在50°C保温lh，残留酶活低于20%，在60°C保温lh，该酶完全丧失催化活性。而在30°C和40°C有较好的热稳定性，残留酶活在80%以上。
【权利要求】
1.一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌，是将来源于米曲霉JN-412(CGMCC N0.8474)的编码成熟脯氨酸氨肽酶基因导入E.coli BL2KDE3)得到的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述成熟脯氨酸氨肽酶基因序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，步骤如下: .1)从米曲霉JN-412(CGMCC N0.8474)菌丝体中提取总RNA，并按照反转录试剂盒推荐条件合成双链cDNA ； .2)根据pap基因的特异性，设计引物从双链cDNA中克隆出脯氨酸氨肽酶基因，将所述脯氨酸氨肽酶基因转化E.coli DH5 a，得到重组质粒pMD19_pap ； .3)将步骤2)获得的脯氨酸氨肽酶基因克隆到载体pET-28a(+)，转化E.coliBL21 (DE3)，获得基因工程菌。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)根据pap 基因的特异性，设计上游引物 Pl:5’CGGGATCCATGGCTGCCAAACTAGTAGAC3’ ；下游引物P2:5’ ATAAGAATGCGGCCGCCTAATCAATAGAGTCG3’，以双链cDNA为模板，克隆目的基因；PCR 体系为:1011]\1引物？1和？2个2111，模板2111，？1^11^141? Max DNA 聚合酶 25yL，双蒸水补齐50 ii L ;PCR条件:98oC预变性5min ;98oC变性10s，59oC退火5s，72oC延伸90s，.38个循环；72oC后延伸IOmin ;目的基因PCR产物胶回收，末端加“A”，反应体系为:胶回收DNA 片段 25 iiL，IOXPCR buffer5 u L, dNTPs4 y L，双蒸水补足 50 y L ;反应条件为:72oC，.30min ;将加“A”后的DNA片段与T Vector pMD19-T(Simple)混合，于16oC过夜连接，转化E.coli DH5 a，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑去20个转化子，提取重组质粒并就行质粒PCR和双酶切验证后送上海生工测序，重组质粒即pMD19-pap ； 2)将重组质粒pMD19-pap和空载pET-28a(+)分别进行双酶切并切胶回收。胶回收产物于16oC过夜连接，转化E.coli DH5 a，在含卡那霉素抗性的LB平板挑取转化子，提取重组质粒并就行PCR和双酶切验证后测序，重组质粒即pET-28a(+)-pap ;将阳性克隆转化E.coli BL21 (DE3)，在含卡那霉素抗性的LB平板挑取单菌落做表达验证。
5.一种发酵生产脯氨酸氨肽酶的方法，其特征在于以权利要求1所述基因工程菌为生产菌株，挑取单菌落于5mL LB培养基中，其中含卡那霉素50ii g/mL，37oC、200rpm过夜培养，再按1%的接种量转接至50mL LB培养基，其中含卡那霉素50 y g/mL中37oC、200rpm培养至0D600值在0.8~1.0之间，加入IPTG至终浓度0.5mM, 25oC、200rpm培养6h后，.10,OOOrpm离心3min,弃上清,细胞沉淀用40mL50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液重新悬浮，超声破碎，离心收集上清，获得脯氨酸氨肽酶。
【文档编号】C12N1/21GK103695361SQ201310656778
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】田亚平, 丁国伟, 吴延涛 申请人:江南大学