一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明提出了一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途。所述引物为SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的序列；所述探针为SEQ?ID?NO:4的序列，其5’端单链碱基序列，其为与靶序列互补的5-10个碱基；中间13-20个碱基；3’端序列，为5-10个碱基序列；所述5’端单链碱基序列与3’端序列部分匹配成颈结构；所述探针为颈环结构，TM值=（颈环TM值+7）±1，5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，共约23-32bp；其5’端和3’端分别标记荧光和非荧光淬灭基团。本发明的引物和探针具有稳定的线性结构，用于检测人巨细胞病毒核酸定量具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的优点。
【专利说明】—种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外诊断试剂。尤其涉及一种人巨细胞病毒核酸定量检测引物和探针、试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002]人巨细胞病毒(Human Cytomegalo virus,HCMV)属疱疫病毒科乙组疱疫亚科。现有的人巨细胞病毒核酸定量检测方法有一系列的问题，比如电镜技术虽直接、客观，但对病毒滴度要求高，设备昂贵，并且需要熟练的技术人员，因此检测价值较低。病毒分离由于技术要求高，分离时间长，易污染的缺点也不易于大量开展。用常规PCR检测CMV-DNA，具有简便、快捷等特点。但是由于扩增后的产物需电泳检测，易造成交叉污染出现假阳性的结果。
[0003]突光定量PCR是(realtimefluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是 1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术,它是通过突光染料或突光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种具有稳定的线性结构的引物和探针，还在于提供一种具有较低的荧光本底值、信噪比高和检测灵敏度高的人巨细胞病毒核酸定量检测方法。
[0005]为实现上述 目的，本发明提供一种人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；所述探针的序列为--从5’端起，与靶序列互补的5-10个碱基的单链碱基序列；中间13-20个碱基的环状结构序列；3’端的5-10个碱基序列；所述5’端的与靶序列互补的5-10个碱基与3’端的5-10个碱基序列部分匹配成颈结构；所述探针成颈环结构，同时探针TM值=(颈环TM值+7)±1，探针5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，探针序列约23-32bp ;所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记非荧光淬灭基团。
[0006]所述探针序列为SEQ ID NO:4的序列。
[0007]所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记Dabcyl非荧光淬灭基团。
[0008]本发明还保护一种人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括上述的任一引物和探针。
[0009]还包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂、参考品试剂和HCMV定量标准品。
[0010]所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为Trizirn*HC1、二氧化娃、Triton X_100、EDTA.2Na、异硫氰酸胍；所述洗漆液为Trizma?.HCl、TritonX-100、EDTA *2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为TH HCl、Triton X_100、EDTA.2Na ；所述PCR扩增试剂为HCMV PCR反应管和HCMV反应缓冲液；所述参考品试剂为HCMV阴性对照、HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照；优选的，所述裂解液为10mMPH7.0 Trizma^;HCl,I重量％。二氧化硅、I体积％。Triton X-1OOUOmM EDTA *2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.0 TrizieaS HClU体积％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为 10mMPH7.0 Trizma* HCl、I 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na ;所述 HCMV PCR反应管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蜡油；HCMV反应缓冲液为 IOpM HCMV 引物，5pM HCMV 探针、20mMPH9.0 Trizma?丨 HCl、50mM KCl、1.5mM MgC12、0.1mMEDTA.2Na、0.2mM dNtps。
[0011]本发明还提供一种应用所述引物和探针或所述试剂盒进行人巨细胞病毒核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，
[0012]样品制备；制备得到纯化的核酸；
[0013]PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1-3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒;
[0014]结果判定。
[0015]所述样品制备为取0.5mL离心管加入裂解液100 μ L然后加入待测样本50 μ L，混悬，室温静置10分钟进行裂解；10000g离心25秒，去上清；加入150 μ L洗涤液对所得到的沉淀进行洗涤，混悬，1000Og离心25秒，去上清；加入150 μ L重复洗涤液，混悬，1000Og离心25秒，去上清备用，纯化得到的沉淀即为核酸；所述裂解液为10mMPH7.0TriziieflHClU重量％。二氧化硅、I体积％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.0 Trizma?:HCl、l 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na、2M 异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为 10mMPH7.0 Trizma?: HClU 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na。
[0016]所述PCR扩增程序为，38 °C 5分钟，95 °C 10分钟；进入以下循环:95 °C 15秒，580C 50秒，共40循环；所述荧光值读取为在PCR扩增每个循环的58°C，30秒时。
`[0017]所述结果判定为:
[0018]如果检测样本中病毒载量为5.0X 102Copies/mL ( HCMV DNA ( 5.0 X IO8Copies/HiL判断为阳性，直接报告定量结果；
[0019]如果检测样本中病毒载量为> 5.0X 108Copies/mL,判断为阳性，报告为>5.0X 108Copies/mL ；
[0020]如果检测样本中病毒载量为OCopies/ml,判断为阴性,报告为0.0Copies/ml ；
[0021]如果检测样本中病毒载量为< 5.0X102Copies/mL，Copies数仅供参考，建议重新检测。
[0022]样本提纯试剂用于提取人巨细胞病毒样本中的核酸，所提取的核酸可以直接用于荧光定量PCR。
[0023]制备的核酸分别用反应缓冲液30 μ L融解，取25 μ L依次加入反应管中，混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。扩增曲线通过连接于PCR扩增仪的终端电脑获取，用于分析是否感染人巨细胞病毒。
[0024]参考品用于检测核酸提取过程和PCR扩增过程是否正常进行。
[0025]本发明的试剂盒具体可以包括:
[0026]样本提纯试剂
[0027]裂解液1.1mL/支，2支；[0028]洗涤液1.6mL/支，2支；
[0029]重复洗涤液，1.6mL/支，2支；
[0030]PCR扩增试剂:
[0031 ] HCMV PCR 反应管，2 μ L/ 支，20 支；
[0032]HCMV反应缓冲液，350 μ L/支，2支；
[0033]参考品试剂:
[0034]HCMV 阴性对照，165 μ L/ 支，I 支；
[0035]HCMV临界阳性对照，165 μ L/支，I支；
[0036]HCMV强阳性对照，165 μ L/支，I支。
[0037]HCMV定量标准品，165 μ L/支，共5支。
[0038]具体的:
[0039]HCMV阴性对照:生理盐水；
[0040]HCMV临界阳性对照:生理盐水、5.0 X 103copies/mL的HCMV质粒；
[0041]HCMV强阳性对照:生理盐水、5.0X 107copies/mL的HCMV质粒。
[0042]HCMV定量标准品见表2
[0043]
【权利要求】
1.一种人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2的序列；所述探针的序列从5’端起，与靶序列互补的5_10个碱基的单链碱基序列；中间13-20个碱基的环状结构序列；3’端的5-10个碱基序列；所述5’端的与靶序列互补的5-10个碱基的单链碱基序列与3’端的5-10个碱基序列部分匹配成颈结构；所述探针成颈环结构，同时探针TM值=(颈环TM值+7)±1，探针5’端有18-25个碱基能够和靶基因完全匹配，探针序列约23-32bp ;所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记非荧光淬灭基团。
2.权利要求1的人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针序列为SEQ ID NO:4的序列。
3.权利要求1或2的人巨细胞病毒核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记Dabcyl非荧光淬灭基团。
4.一种人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3的任一引物和探针。
5.权利要求4的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，还包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂、参考品试剂。
6.权利要求5的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为TrizmafflHCl、二氧化硅、TritonX-100、EDTA *2Na、异硫氰酸胍；所述洗涤液为 TrimaP HCl、Triton X-100、EDTA.2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为Triz!ua?: HC1、Triton X-100、EDTA.2Na ;所述PCR扩增试剂为HCMV PCR反应管和HCMV反应缓冲液；所述参考品试剂为HCMV阴性对照、HCMV临界阳性对照，HCMV强阳性对照和HCMV定量标准品；优选的，所述裂解液为10mMPH7.0 Trizim^iHCl,I重量％。二氧化硅、I体积％。Triton X-1OOUOmM EDTA *2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.0 Trizma?iHCl 、l 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M 异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为 10mMPH7.0 T rizma*: HCl、I 体积％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na ;所述 HCMV PCR反应管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蜡油；HCMV反应缓冲液为 IOpM HCMV 引物，5pM HCMV 探针、20mMPH9.0 Trizma*]HC1,5OmM KC1、1.5mM MgC12、0.1mMEDTA.2Na、0.2mM dNtps。
7.一种应用权利要求1-3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒进行人巨细胞病毒核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤， 样品制备；制备得到纯化的核酸； PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1-3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒； 结果判定。
8.权利要求7的人巨细胞病毒核酸定量检测方法，其特征在于，所述样品制备为取，0.5mL离心管加入裂解液100 μ L，然后加入待测样本50 μ L，混悬，室温静置10分钟进行裂解；10000g离心25秒，去上清；加入150 μ L洗涤液对所得到的沉淀进行洗涤，混悬，1000Og离心25秒，去上清；加入150 μ L重复洗涤液，混悬，1000Og离心25秒，去上清备用，纯化得到的沉淀即为核酸；所述裂解液为10mMPH7.0 Tii zma* HCl、I重量％。二氧化硅、I体积％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M 异硫氰酸胍;所述洗涤液为 10mMPH7.0 Triznia*HClU体积％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为.10mMPH7.0 Trizma*] HCl、I 体积％? Triton X-1OOUmM EDTA.2Na。
9.权利要求8的人巨细胞病毒核酸定量检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为，380C 5分钟，95°C 10分钟；进入以下循环:95°C 15秒，58°C 50秒，共40循环；所述荧光值读取为在PCR扩增每个循环的58°C，30秒时。
10.权利要求8的人巨细胞病毒核酸定量检测方法，其特征在于，所述结果判定为: 如果检测样本中病毒载量为 5.0X 102Copies/mL ≤ HCMV DNA ≤ 5.0 X 108Copies/mL 判断为阳性，直接报告定量结果； 如果检测样本中病毒载量为> 5.0X 108CopieS/mL，判断为阳性，报告为>.5.0X 108Copies/mL ； 如果检测样本中病毒载量为OCopies/ml,判断为阴性,报告为0.0Copies/ml ；如果检测样本中病毒载量为< 5.0X102Copies/mL，Copies数仅供参考，建议重新检测。
【文档编号】C12Q1/68GK103805713SQ201410007284
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】魏超, 林家旺, 魏劭 申请人:厦门安普利生物工程有限公司